Pembuatan Suspensi Bakteri Endofit Introduksi Bakteri Endofit

3.5Uji Kemampuan Menambat N 2 dari Udara Uji bakteri endofit menambat N 2 dilakukan dengan metode asai reduksi asetilen ARA FAO, 1983.Isolat-isolat bakteri endofit ditumbuhkan pada medium NFB cair pada suhu ruang selama satu hari. Selanjutnya kultur berumur satu hari dengan populasi sekitar 10 9 sel ml -1 tersebut diinokulasikan sebanyak 100 µl pada 10 ml medium NFB semi padat dan diinkubasi selama 10 hari pada suhu ruang. Analisis reduksi asetilen dilakukan setelah terbentuk suatu pelikel berwarna putih pada inkubasi 10 hari. Analisis ini diawali dengan melakukan penggantian tutup kapas dengan tutup karet. Selanjutnya diambil 10 udara yang tersisa pada tabung dengan menggunakan jarum suntik dan diganti dengan gas asetilen, diikuti dengan perlakuan inkubasi selama satu jam. Etilen yang terbentuk dideteksi dan diukur dengan menggunakan gas kromatografi GC. Pengujian ini dilakukan di IPB, Bogor.

3.6 Pembuatan Suspensi Bakteri Endofit

Pembuatan suspensi bakteri endofit dilakukan menurut metode Bresson Borges 2003. Biakan bakteri endofit disubkultur dalam media NA dan diinkubasi selama ± 2 hari. Hasil subkultur biakan bakteri endofit diambil dengan jarum ose dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml akuades steril. Setelah itu dihomogenkan dengan cara divortex dan disamakan kekeruhannya dengan standar Mac Farland sehingga diperoleh suspensi bakteri dengan kerapatan sel 10 8 CFUml.

3.7 Introduksi Bakteri Endofit

Introduksi bakteri endofit dilakukan melalui metode potong+rendam Irfan, 2009; Efendi, 2009 karena bakteri membutuhkan waktu dan proses yang lama untuk sampai Universitas Sumatera Utara masuk ke dalam jaringan akar dan satu sebagai kontrol dengan 3 kali ulangan untuk masing-masing perlakuan. Untuk perlakuan metode potong+rendam yaitu bibit kelapa sawit yang telah berumur ± 2 minggu, dicabut dari polibag kemudian dicuci dan direndam dalam 20 ml suspensi bakteri endofit dengan kerapatan sel 10 8 CFUml selama 60 menit dan dilakukan pemotongan bagian akarnya secara aseptis ± 2 cm. Kontrol tanpa bakteri endofit diperlakukan sama tetapi hanya menggunakan akuades steril. 3.8Reisolasi Bakteri Endofit Setelah minggu terakhir pengamatan dilakukan reisolasi bakteri endofit dan pengamatan mikroskopis bakteri endofit di dalam jaringan tanaman secara histologis. Reisolasi bakteri endofit dari akar tanaman kelapa sawit dilakukan menurut metode Radu Kqueen 2002. Tahap awal yang dilakukan adalah mencuci bagian akar tanaman 3-5 cm dengan air mengalir selama 20 menit. Bagian permukaan akar tanaman disterilisasi dengan merendam secara berturut-turut di dalam larutan etanol 75 selama 2 menit, larutan sodium hipoklorit 5,3 selama 5 menit, dan etanol 75 selama 30 detik, dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali. Akar tanaman yang sudah steril selanjutnya dihaluskan dengan alu lumpang lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril yang berisi akuades steril dengan perbandingan 1:10 sehingga konsentrasi kultur cair awal adalah 10 -1 . Kultur cair diambil sebanyak 1 ml dan dituang ke dalam cawan petri steril dengan metode cawan tuang lalu diinkubasi dan dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri endofit yang tumbuh Lampiran 6 hlm 34. Universitas Sumatera Utara BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Isolasi dan Karakteristik Bakteri Endofit Hasil isolasi bakteri endofit diazotrof pada akar kelapa sawit diperoleh 20 isolat bakteri ciri karakterisasi morfologi, koloni sel dan sifat biokimia dari 20 bakteri endofit diazotrof Tabel 1. Dari Tabel 1 menunjukkan warna koloni bakteri endofit bervariasi, warna krem terdapat pada isolat NFB 1, NFB 6, NFB 7, NFB 13, NFB 14, NFB 15, NFB 19 dan NFB 20, warna putih pada isolat NFB2, NFB3, NFB 4, NFB5, NFB 8, NFB9, NFB 10, NFB 11 dan NFB 12. Sedangkan warna merah pada isolat NFB 16 dan NFB 18, warna merah muda pada isolat NFB 17. Dari Tabel 1 juga menunjukkan bahwa sebagian besar bakteri endofit kelapa sawit adalah Gram negatif hanya satu yang merupakan Gram positif yaitu NFB 17. Dari hasil penelitian Kumala 2008 akar kelapa sawit kebanyakan bakteri endofit diazotrof adalah Gram negatif dan berbentuk basil seperti Herbaspirillum spp. dan Azotobacter. Sebagian besar bakteri endofit diazotrof pada akar kelapa sawit berbentuk basil kecuali NFB 1 berbentuk kokus.Penelitian yang telah dilakukan oleh Khairani 2010 mendapatkan hasil bakteri endofit yang berbentuk basil lebih banyak dari pada bakteri berbentuk kokus pada tanaman padi. Universitas Sumatera Utara Tabel 1.Karakterisasi sifat morfologi koloni dan sel, dan sifat biokimia bakteri endofit yang disolasi dari kelapa sawit Kode bakteri Warna koloni Bentuk Sel G r am M ot ilita s Ge la tin S itr at K at al as e TS IA Pat i G lukos a Sukr os a L ak tos a K ere tak a E ndap an h itam NFB 1 krem kokus - + - - + - - - - - - NFB 2 putih basil - + - + + + + + - - - NFB 3 putih basil - + - + + + - - - - - NFB 4 putih basil - + - - - - - - - - - NFB 5 putih basil - + - - + + - - - - + NFB 6 krem basil - + - - + - - - - - - NFB 7 krem basil - - - + + - - - - + - NFB 8 putih basil - + - + + + - - - - - NFB 9 putih basil - - - + + + + + - + - NFB 10 putih basil - - - + + - - - - + - NFB 11 putih basil - + - + + + - - - - - NFB 12 putih basil - + - + + + - - - - - NFB 13 krem basil - + - + + - - - - - - NFB 14 krem basil - + - + + + + + - - - NFB 15 krem basil - + - - + + - - - - - NFB 16 merah basil - + - + + + + + - - - NFB 17 pink basil + + - + + + + + - - - NFB 18 merah basil - + - - + + + + - - - NFB 19 krem basil pendek - + - + + + - - - - - NFB 20 krem basil - + - - + + - - - - - Keterangan: + : positif - : negatif TSIA : Triple Sugar Iron Agar Uji biokimia sederhana yang dilakukan meliputi uji motilitas, uji gelatin, uji sitrat, uji katalase, uji hidrogen sulfida dan uji pati. Uji motilitas yang dilakukan menunjukkan Universitas Sumatera Utara bahwa isolat NFB 7, NFB 9 dan NFB 10 bersifat tidak motil yang ditandai dengan tidak adanya jejak pergerakan bakteri di dalam medium, sedangkan 17 isolat lainnya bersifat motil. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri mencari nutrisi untuk berkembang biak. Hasil uji sitrat mengindikasikan bahwa isolat NFB 1, NFB 4, NFB 5, NFB 6, NFB 18 dan NFB 20 tidak mampu menggunakan Na-sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon sedangkan isolat lainnya mampu menggunakan Na-sitrat sebagai sumber karbon. Pada uji gelatinase semua isolat menunjukkan hasil yang negatif yang tidak mencerna gelatin.Penelitian yang dilakukan oleh Khairani 2010 yang mengisolasi bakteri endofit pada tanaman padi juga mendapatkan hal yang serupa pada uji gelatin.Sedangkan pada uji hidrolisis pati hanya satu isolat yaitu NFB 5 menunjukkan hasil positif dengan adanya zona bening disekitar koloni.Hal ini menandakan bahwa isolat tersebut mampu menghidrolisis pati. Dari uji katalase dengan penambahan larutan H 2 O 2 3 mengindikasikan bahwa isolat NFB 4 tidak memiliki enzim katalase yang ditandai dengan tidak terbentuknya gelembung udara disekitar koloni bakteri sedangkan isolat lainnya memiliki enzim katalase. Menurut Lay 1994, mikroorganisme tumbuh dan berkembang biak dengan berbagai bahan yang terdapat dalam lingkungan. Zat hara yang terdapat di sekeliling dari molekul sederhana seperti H 2 S dan NH 4 + atau molekul organik yang kompleks seperti protein dan disakarida.Penggunaan zat hara tergantung aktivitas metabolisme mikroba.Metabolisme sering kali menghasilkan hasil sampingan yang dapat digunakan untuk identifikasi mikroba. Pengamatan aktivitas metabolisme ini diketahui dari kemampuannya untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang komplek seperti disakarida pati, lemak, protein, asam nukleat dan asam amino. Hasil dari berbagai uji ini digunakan untuk menunjukkan spesifikasi setiap mikroorganisme.

4.2 Uji Kemampuan Menambat N