BAB 3
BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada Bulan Maret sampai Agustus 2011 di Laboratorium Mikrobiologi dan rumah kasa FMIPA USU Medan.
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan adalah isolat bakteri endofit, kecambah kelapa sawit varietas
Dura Pasifera Gambar 1 yang sehat diperoleh dari Pusat Penelitian Kelapa Sawit PPKS Medan. Nutrien Agar NA, akuades steril, sodium hipoklorit 5,3, etanol
70. Media Nitrogen Free Bromthymol Blue NFB semi solid. Komposisi media dapat dilihat pada Lampiran 5 hlm 33.
Gambar 1.Kecambah kelapa sawit Elaeis guineensis Jaqc. var. Dura Pasifera
umur 3 bulan dengan a. plumula dan b. radikula
a
b.
Universitas Sumatera Utara
3.3 Sterilisasi dan IsolasiAkar Sawit
Sterilisasi bakteri endofit dari akar kelapa sawit yang dilakukan menurut metode Radu Kqueen 2002 yaitu akar kelapa sawit diambil dari lokasi segera dicuci untuk
menghilangkan kotoran yang menempel, dikeringkan, lalu dibungkus dengan kertas koran dan dimasukkan ke dalam kantong plastik. Selanjutnya akar kelapa sawit dibawa
ke laboratorium untuk tahap isolasi. Tahap awal yang dilakukan adalah mencuci bagian akar dan dipotong-potong sepanjang 2-3 cm dengan air mengalir selama 20
menit, kemudian disterilisasi dengan merendamnya di dalam larutan secara berturut-turut: etanol 75 selama 2 menit, larutan sodium hipoklorit 5,3 selama 5 menit, dan etanol
75 selama 30 detik, lalu dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali, dikeringkan dengan kertas saring steril. Setelah kering, bagian ujung kiri dan kanan akar tanaman
dibuang ± 1 cm agar lebih bersih.Bagian akar diletakkan di dalam media agar NFB. Koloni yang muncul dari bagian akar tanaman sebelah dalam disubkultur ke media
agar NFB yang baru sampai didapatkan biakan murni.Isolat murni yang diperoleh dikarakterisasi morfologinya dengan pewarnaan Gram dan uji biokimia metabolisme
bakteri uji sitrat, uji motilitas, uji gelatin, uji sulfida, uji katalase dan uji hidrolisis pati Lay, 1994.
3.4 Persiapan Kecambah Kelapa Sawit
Kecambah kelapa sawit umur 3 bulan disterilkan dengan cara direndam dalam larutan sodium hipoklorit 5,3 selama ± 1 menit, kemudian dibilas dengan akuades
steril, lalu direndam dalam etanol 70 selama ± 5 detik dan dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali. Kecambah kelapa sawit steril ditanam dalam polibag berukuran diameter
x tinggi yaitu 17x35 cm yang telah berisi tanah yang telah disterilkan dengan cara mengukusnya selama ± 3 jam. Kecambah disiram setiap hari dengan akuades steril
hingga kecambah berumur 2 minggu.
Universitas Sumatera Utara
3.5Uji Kemampuan Menambat N
2
dari Udara
Uji bakteri endofit menambat N
2
dilakukan dengan metode asai reduksi asetilen ARA FAO, 1983.Isolat-isolat bakteri endofit ditumbuhkan pada medium NFB cair
pada suhu ruang selama satu hari. Selanjutnya kultur berumur satu hari dengan populasi sekitar 10
9
sel ml
-1
tersebut diinokulasikan sebanyak 100 µl pada 10 ml medium NFB
semi padat dan diinkubasi selama 10 hari pada suhu ruang. Analisis reduksi asetilen dilakukan setelah terbentuk suatu pelikel berwarna putih pada inkubasi 10 hari. Analisis
ini diawali dengan melakukan penggantian tutup kapas dengan tutup karet. Selanjutnya diambil 10 udara yang tersisa pada tabung dengan menggunakan jarum suntik dan
diganti dengan gas asetilen, diikuti dengan perlakuan inkubasi selama satu jam. Etilen yang terbentuk dideteksi dan diukur dengan menggunakan gas kromatografi GC.
Pengujian ini dilakukan di IPB, Bogor.
3.6 Pembuatan Suspensi Bakteri Endofit
