2 Ekstraksi senyawa antibakteri dengan waktu pemecahan sel yang berbeda
Pada saat kultur C. gracilis mencapai fase stasioner atau kultur berumur 14 hari, dilakukan panen biomassa menggunakan filter keramik untuk
memisahkan filtrat dan biomassanya. Biomassanya dibekukan dalam freezer sampai membeku. Setelah membeku, biomassa dikeringkan dengan
menggunakan freeze dryer Yamato FD 30 hingga diperoleh biomassa dalam bentuk bubuk. Biomasa yang sudah didapat kemudian diambil sebanyak 0,9 gram
dan dibagi menjadi 0,3 gram untuk masing-masing perlakuan yaitu pemecahan sel selama 5, 10 dan 15 menit. Setelah itu, biomassa dimasukkan ke dalam tabung
dan ditambah metanol sebanyak 5 ml dan dilakukan pemecahan sel menggunakan glass beads dengan perbandingan 1 : 2 glass beads g : larutan ml . Larutan
tersebut selanjutnya diaduk menggunakan vortex selama selang waktu perlakuan yaitu 5, 10 dan 15 menit.
Selanjutnya biomasa tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan metanol 98 sehingga perbandingan biomassa dengan metanol
sebanyak 1 : 25. Larutan biomassa yang telah melalui proses disruption pemecahan sel dengan glass beads kemudian dimaserasi. Maserasi dilakukan
dengan menggunakan pengaduk magnet pada suhu kamar selama + 3 x 24 jam dengan kecepatan 50 rpm.
Setelah proses ekstraksi berlangsung dilakukan penyaringan dengan kertas saring Whatman no. 42. Selanjutnya pelarut metanol diuapkan dengan
menggunakan rotavapor vakum Yamato RE 50 pada suhu 35-37
o
C dengan kecepatan 100 rpm selama + 15 menit hingga diperoleh ekstrak filtrat yang
berbentuk pasta. Setelah mendapatkan ekstrak dalam bentuk pasta selanjutnya dilakukan
pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar. Waktu pemecahan sel yang memiliki yield paling banyak dan zona hambat yang paling besar digunakan
untuk tahap penelitian selanjutnya.
3.3.2. Penelitian utama
Penelitian utama bertujuan untuk menentukan intensitas cahaya terbaik yang menghasilkan senyawa antibakteri dengan yield dan zona hambat
yang paling besar. Penelitian utama meliputi kultivasi C. gracilis, ekstraksi senyawa antibakteri C. gracilis dengan jarak pencahayaan kultur yang berbeda
yaitu 3, 9 dan 15 cm.
1 Kultivasi Chaetoceros gracilis tahap II
Tahap ini dimulai dengan pembuatan kultur mikroalga C. gracilis. Kultivasi C. gracilis dibuat dalam erlenmeyer 1 liter sebanyak 3 buah yang berisi
larutan medium sebanyak 900 ml. Medium kultur yang digunakan adalah Medium Guillard yang telah dimodifikasi Lampiran 1. Air laut yang digunakan,
sebelumnya telah disterilkan dengan proses perebusan pada suhu 100 C
selama 15 menit. Kultivasi dilakukan pada suhu ruang 29-30
o
C dengan penyinaran memakai lampu 20 watt dan pemberian aerasi selama 24 jam. Kultivasi
dilakukan dengan 3 perlakuan sebagai berikut: A. Kultur ke-1 , yaitu kultivasi dengan jarak penyinaran 3 cm ± 3500 lux
B. Kultur ke-2 , yaitu kultivasi dengan jarak penyinaran 9 cm ± 2500 lux C. Kultur ke-3 , yaitu kultivasi dengan jarak penyinaran 15 cm ± 1500 lux
Pertumbuhan C. gracilis diamati dengan cara mengambil sampel setiap hari, kemudian dihitung jumlah selnya secara langsung yang selanjutnya nilainya
dikonversikan ke dalam nilai logaritmik. Setelah itu dibuat kurva pertumbuhan dengan jumlah sel logaritmik sebagai sumbu y dan waktu hari sebagai
sumbu x.
2 Ekstraksi antibakteri dengan waktu pemecahan sel terpilih
Tahap ini dimulai dengan membuat kultur C. gracilis sebanyak 6 liter untuk masing-masing perlakuan jarak pencahayaan. Pada saat masing–masing
kultur mencapai fase pertengahan stasioner, kultur dipanen dengan menggunakan filter keramik. Selanjutnya filtrat dibuang sedangkan biomassanya dibekukan
dalam freezer sampai membeku. Setelah membeku, biomassa dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer hingga diperoleh biomassa dalam bentuk bubuk.
Selanjutnya dilakukan proses pemecahan sel dengan cara biomassa dilarutkan dalam metanol sebanyak 5 ml, lalu ditambahkan glass beads dengan perbandingan
1 : 2 glass beads g : larutan ml , kemudian larutan diaduk dengan vortex dengan waktu pemecahan sel yang terbaik.
Larutan biomassa yang telah melalui proses disruption pemecahan sel dengan glass beads kemudian dimaserasi. Maserasi dilakukan dengan
menggunakan pengaduk magnet pada suhu kamar selama + 3 x 24 jam dengan kecepatan 50 rpm. Setelah proses ekstraksi berlangsung dilakukan penyaringan
dengan kertas saring Whatman no. 42. Selanjutnya pelarut metanol diuapkan dengan menggunakan rotavapor vakum suhu 35-37
o
C dengan kecepatan 100 rpm selama + 15 menit hingga diperoleh ekstrak.
Setelah mendapatkan ekstrak antibakteri dalam bentuk pasta maka dilakukan pengujian aktivitas antibakteri dengan teknik tabung pengenceran.
Sebelum uji aktivitas, dipersiapkan dahulu kultur bakteri yang berada pada fase log dan memiliki OD antara 0,5 – 0,9.
3.4. Prosedur Analisis 3.4.1 Penghitungan jumlah sel
