Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCCT
suhu kamar, jadi senyawa yang tidak tahan panas dapat ditangani dengan mudah. Peralatan KCKT memiliki kepekaan yamg sangat tinggi sehingga menghasilkan
data yang lebih akurat dan membutuhkan waktu yang tidak lama Munson, 1991. Kemajuan dalam tekhnologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan
detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan pada KCKT menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi Munson, 1991.
Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC High Perfomance Liquid Chromatography dikembangkan pada akhir
tahun 1960-an dan awal 1970-an. KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-
asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-
produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan; memurnikan senyawa dalam suatu campuran; memisahkan
polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran; kontrol kualitas; dan mengikuti jalannya reaksi sintetis Gandjar, 2007.
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara
tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran
sampel Gandjar, 2007.
KCKT digunakan untuk senyawa-senyawa tak atsiri, berbobot molekul tinggi, anorganik, tidak tahan panas dan lain sebagainya. Kepekaan dari peralatan KCKT
sangat tinggi sehingga menghasilkan data yang lebih akurat dan membutuhkan waktu yang tidak lama. Cepatnya perkembangan KCKT didukung oleh
perkembangan peralatan yang handal dan kolom yang efisien Munson, 1991. KCKT pada sat ini merupakan metode kromatografi cair paling akhir. Dalam
beberapa tahun terakhir ini teknologi KCKT dan pemakaiannya sangat berkembang, walaupun membutuhkan biaya yang relatif tidak sedikit tapi saat ini
merupakan suatu tekhnik yang banyak digunakan pada perusahaan obat Munson, 1991.
KCKT merupakan salah satu metode yang mempunyai banyak keuntungan, diantaranya adalah sebagai berikut:
1. Cepat. Untuk analisis yang tidak rumit, dapat dicapai waktu analisis
kurang dari 5 menit. 2.
Daya pisahnya baik. Kemampuan linarut berinteraksi dengan fase diam dan fase gerak memberikan parameter pencapaian pemisahan yang
dikehendaki. 3.
Peka detector unik. Detector yang dipakai adalah uv 254 nm yang dapat mendeteksi berbagai jenis senyawa dalam jumlah nanogram.
4. Kolom dapat dipakai kembali tetapi mutunya turun. Laju penurunan mutunya bergantung pada jenis cuplikan yang disuntikkan, kemurnian
pelarut,dan jenis pelarut yang dipaki. 5. Ideal untuk molekul besar dan ion.
6. Mudah memperoleh kembali cuplikan karena detector tidak merusak cuplikan. Pelarut dapat dihilangkan dengan penguapan Johnson dan
Stevenson, 1991 Pada dasarnya instrumen KCKT terdiri dari :
1. Sistem Pompa Pompa harus tahan terhadap semua jenis pelarut, dapat mencapai tekanan
sampai 6000 pada saat ini, harus bebas denyut, dan dapat menghantarkan aliran terukur 0,01 – 1,0 atau 0,1 - 20 ml menit. Selain itu, pompa harus
mempunyai batas volume minimum sehingga memungkinkan pergantian pelarut dengan cepat dan elusi landaian secara efisien. Laju aliran biasanya
dikendalikan dengan tombol pada pompa normal atau dengan mikroprosesor pada pompa niaga yang lebih canggih Gritter, dkk., 1991.
2. Tandon pelarut Bahan tandon harus lembam terhadap fase gerak berair dan tidak berair.
Sehingga baja anti karat dan gelas menjadi pilihan. Baja anti karat jangan dipakai pada pelarut yang mengandung ion halida dan jika tandon harus
bertekanan, hindari penggunaan gelas. Daya tampung tandon harus lebih dari 500 ml digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir 1 – 2 mlmenit
Munson, 1991. 3. Pipa
Pipa merupakan penyambung dari seluruh bagian sistem. Garis tengah dalam pipa sebelum penyuntik tidak berpengaruh, hanya saja harus lembam,
tahan tekanan dan mampu dilewati pelarut dengan volume yang memadai Munson, 1991.
4. Penyuntik Sistem Penyuntik Cuplikan Teknik penyuntikan harus dilakukan dengan cepat untuk mencapai
ketelitian maksimum pada analisis kuantitatif, yang terpenting adalah sistem harus dapat mengatasi tekanan balik yang tinggi tanpa kehilangan terokan
fase gerak. Pada saat pengisian terokan, terokan dialirkan melewati keluk dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup
diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk kolom Munson, 1991. 5. Fase Diam
Fase diam dapat berupa permukaan zat padat yang berfungsi sebagai medium yang menjerap, atau permukaan zat cair yang terdapat pada sejenis
zat padat. Banyak sistem fase diam baru telah dikembangkan untuk KCKT, dan pemakaian bahan tersebut sangat meningkatkan keefisienan dan
kemampuan metode itu. Sebagian besar bahan itu didasarkan pada silika Gritter, dkk., 1991.
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan
divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol Si-OH. Oktadesil silika ODS atau C
18
merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-
senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi Gandjar dan Rohman, 2009.
Sekarang ini, gel silika ODS atau fase-fase sejenis seperti gel silika oktil digunakan untuk 80 analisis farmasi namun fase-fase lain hanya
digunakan jika diperlukan selektivitas khusus, misalnya untuk senyawa-
senyawa yang sangat mudah larut dalam air atau untuk pemisahan bioanalisis yang menjadi penting karena matriks sampel tersebut menghasilkan banyak
puncak yang mengganggu Watson, 2005. 6.
Fase Gerak Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut,
polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel Gandjar dan Rohman, 2009.
Pada KCKT, susunan pelarut atau fase gerak merupakan salah satu hal penting yang mempengaruhi proses pemisahan. Berbagai macam pelarut
dipakai dalam semua jenis KCKT, tetapi ada beberapa syarat fase gerak yang digunakan dalam KCKT. Menurut kriteria fase gerak yang ideal adalah
sebagai berikut: 1.
Murni, tanpa cemaran; 2.
Tidak bereaksi dengan kemasan; 3.
Sesuai dengan detektor; 4.
Dapat melarutkan cuplikan; 5.
Mempunyai viskositas rendah; 6.
Memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan;
7. Harganya wajar Jhonson dan Stevenson, 1991.
Pada umumnya, pelarut dibuang setelah digunakan karena tata kerja pemurniannya memakan waktu dan mahal. Dari semua kriteria di atas, 4
kroteria pertama merupakan yang paling penting Jhonson dan Stevenson 1991.
7. Kolom
Kolom merupakan jantung kromatograf, kebersihan atau kegagalan analisis tergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Dianjurkan
untuk mamasang penyaring 2 μm dijalur antar penyuntik dan kolom, untuk menahan partikel yang dibawa fase gerak atau terokan, hal ini dapat
memperpanjang umur kolom Munson, 1991. Kolom dapat dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu :
a. Kolom analitik : garis tengah dalam 2-6mm. untuk kemasan makropartikel panjang kolom 50 -100 cm, untuk kemasan mikropartikel
biasanya panjang kolomnya 10-30 cm. b. Kolom preparatif : garis tengah 6 mm atau lebih panjang 25-100 cm
Johnson dan Stevenson, 1991. Pemilihan kolom yang dipakai untuk cuplikan yang sifatnya tidak dikenal
berdasarkan pada sifat kimia umum linarut, sifat kelarutan dan ukurannya. Kolom dapat dikemas sendiri atau membeli kolom yang sudah dikemas. KCKT biasanya
adalah UV 254 nm. Bila tanggapan detektor lebih lambat dari elusi sampel timbullah pelebaran pita yang memperburuk pemisahan. Pemilihan detektor
KCKT tergantung pada sifat sampel, fase gerak dan kepekaan yang tinggi dicapai Gritter, dkk., 1991.
8. Detektor Detektor harus memberikan cuplikan, tanggapan yang dapat diramalkan,
peka, hasil yang efisien dan tidak terpengarung oleh perubahan suhu atau
komposisi fase gerak. Detektor yang dipakai pada KCKT biasanya adalah UV 254 nm. Bila tanggapan detektor lebih lambat dari elusi sampel timbullah pelebaran
pita yang memperburuk pemisahan. pemilihan detektor KCKT tergantung pada sifat sampel, fase gerak dan kepekaan yang tinggi dicapai Munson, 1991.
9. Penguat Sinyal Pada umumnya sinyal yang berasal dari detektor diperkuat terlebih dahulu
sebelum disampaikan pada alat perekam otomatik yang sesuai, biasanya berupa suatu perekam potensiometrik. Dapat pula sinyal dikirimkan kepada suatu
integrator digital elektronik untuk mengukur luas puncak kromatogram secara otomatik Munson, 1991.
10. Perekam Perekam merupakan salah satu dari bagian peralatan yang berfungsi
merekam atau menunjukkan hasil pemeriksaan suatu senyawa berupa peak puncak. Dari daftar tersebut, secara kualitatif kita dapat mengetahui senyawa
apa yang diperiksa Munson, 1991. Dalam pemisahan suatu senyawa secara KCKT biasanya digunakan suatu
pelarut landaian yaitu pelarut yang dapat diubah-ubah kepolarannya sesuai dengan kebutuhan. Ada beberapa keuntungan jika digunakan pelarut landaian,
diantaranya : a. Waktu analisis keseluruhan dapat berkurang
b. Daya pisah keseluruhan persatuan waktu campuran ditingkatkan c. Bentuk puncak diperbaiki pembentukan ekor lebih kecil
d. Kepekaan efek ditingkatkan karena bentuk puncak kurang beragam Johnson dan Stevenson,1991.