III. BAHAN DAN METODE
3.1. Ikan Uji
Seluruh ikan uji yang digunakan adalah ikan sidat Anguilla sp. yang berasal dari muara Sungai Cimandiri, Pelabuhan Ratu, Sukabumi, Jawa Barat.
Glass eel ditangkap pada satu minggu yang sama dan dikumpulkan oleh pengumpul glass eel di daerah tersebut. Glas eel yang digunakan berukuran
panjang 5,52±0,22 cm, dan bobot 0,13±0,21 gram. Elver yang digunakan hasil pemeliharaan dari ukuran glass eel dengan ukuran panjang 7,45±0,75 cm, dan
bobot 0,54±0,21 gram pada tahap persiapan selama 2 bulan dalam akuarium. Ikan sidat ukuran glass eel dan elver yang digunakan dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5 Benih ikan sidat ukuran glass eel A dan elver B yang digunakan dalam penelitian.
3.2. Produksi Protein GH Rekombinan
Pada penelitian ini digunakan bakteri Escherichia coli BL21 DE3 yang mengandung konstruksi pColdrElGH Alimuddin et al. 2010. Dengan
menggunakan analisis SDS-PAGE telah diketahui bahwa produksi rGH ikan kerapu kertang pada E. coli lebih tinggi daripada rGH ikan mas dan ikan gurami
Lampiran 1. Klon bakteri E.coli BL21 DE3 mengandung pCold-IrElGH yang disimpan dalam stok gliserol dilakukan kultur awal dengan digoreskan ke dalam
media padat 2xYT yang mengandung ampisilin. Hasil goresan bakteri diinkubasi
A B
dalam suhu 37
o
C selama 24 jam. Selanjutnya hasil kultur media padat tersebut diambil koloni tunggalnya untuk dilakukan subkultur pertama dalam 5 mL media
2xYT cair yang mengandung ampisilin tabung L, dan diinkubasi menggunakan shaker pada suhu 37
o
C selama 18 jam. Setelah itu, dilakukan subkultur kedua dengan mengambil sebanyak 1 dari kultur awal dan dimasukkan ke dalam 60
ml media 2xYT cair baru dan diinkubasi lagi pada suhu 37
o
C selama 2 jam. Induksi produksi rGH dilakukan dengan memberikan kejutan suhu 15
o
C selama 30 menit, ditambahkan IPTG sebanyak 750 µ L dan diinkubasi menggunakan
shaker pada suhu 15
o
C selama 24 jam. Bakteri hasil kultur dikumpulkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit untuk mengendapkan sel.
Pelet bakteri dicuci dengan phosphate buffer saline PBS sebanyak 1 kali dan selanjutnya disimpan pada suhu -80
o
C hingga akan digunakan
Pelet bakteri dicuci menggunakan 1 mL bufer tris-EDTA TE per 200 mg bakteri dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 menit. Setelah bakteri diendapkan dengan sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 1 menit, bakteri dilisis
terlebih menggunakan lisozim sebanyak 500 µL 10 mg dalam 1 ml buffer TE, dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 menit, lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 1 menit. Protein rElGH dalam bentuk badan inklusitidak larut
diendapkan dengan cara sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 1 menit. Pelet rElGH dicuci dengan PBS sebanyak 1 kali dan disimpan pada suhu -80
o
C sampai
akan digunakan.
3.3. Analisis SDS-PAGE
Kategori