dalam suhu 37
o
C selama 24 jam. Selanjutnya hasil kultur media padat tersebut diambil koloni tunggalnya untuk dilakukan subkultur pertama dalam 5 mL media
2xYT cair yang mengandung ampisilin tabung L, dan diinkubasi menggunakan shaker pada suhu 37
o
C selama 18 jam. Setelah itu, dilakukan subkultur kedua dengan mengambil sebanyak 1 dari kultur awal dan dimasukkan ke dalam 60
ml media 2xYT cair baru dan diinkubasi lagi pada suhu 37
o
C selama 2 jam. Induksi produksi rGH dilakukan dengan memberikan kejutan suhu 15
o
C selama 30 menit, ditambahkan IPTG sebanyak 750 µ L dan diinkubasi menggunakan
shaker pada suhu 15
o
C selama 24 jam. Bakteri hasil kultur dikumpulkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit untuk mengendapkan sel.
Pelet bakteri dicuci dengan phosphate buffer saline PBS sebanyak 1 kali dan selanjutnya disimpan pada suhu -80
o
C hingga akan digunakan
Pelet bakteri dicuci menggunakan 1 mL bufer tris-EDTA TE per 200 mg bakteri dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 menit. Setelah bakteri diendapkan dengan sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 1 menit, bakteri dilisis
terlebih menggunakan lisozim sebanyak 500 µL 10 mg dalam 1 ml buffer TE, dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 menit, lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 1 menit. Protein rElGH dalam bentuk badan inklusitidak larut
diendapkan dengan cara sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 1 menit. Pelet rElGH dicuci dengan PBS sebanyak 1 kali dan disimpan pada suhu -80
o
C sampai
akan digunakan.
3.3. Analisis SDS-PAGE
Prosedur pengerjaan SDS-PAGE dilakukan berdasarkan metode Blackshear 1984 dalam Bollag et al. 1996. Konsentrasi gel akrilamid yang
digunakan adalah 10 dan menggunakan pewarnaan coomassie brilliant blue. Marker ukuran protein yang digunakan adalah Pre Stained Protein Marker, Broad
Range 7-175 kDa BioLabs, New England. Analisis protein rElGH menggunakan teknik SDS-PAGE yaitu running gel dan stacking gel 12
mengandung 4,62 ml H
2
O; 5,6 ml AcrylamideBis 29:1:3,5 ml Gel Buffer 1,5 M pH 6,8; 50 µl SDS 10; 50 µl APS 10; dan 5 µl APS 10; dan 5 µl TEMED.
Protein rElGH sebanyak 1 mg ditambahkan 10 µl PBS dan 10 µl loading buffer, kemudian diinkubasi pada suhu 100
C selama 10 menit. loading buffer
mengandung 1,5M Tris-HCl pH 6,8, 2M DDT, SDS 10, bromophenol blue, gliserol 87, dan ddH
2
O. Selanjutnya dimasukkan sebanyak 20 µl ke setiap sumur gel dan elektroforensis pada tegangan 150 Volt dan kuat arus listrik 60 mA.
Setelah itu gel dimasukkan kedalam staining solution metanol, air, coomassie brilliant blue R-250, dan asam asetat glasial selama 3 jam. Lalu gel dimasukkan
ke dalam de-staining solution Ethanol, ddH
2
O, asam asetat glasial selama sekitar 24 jam.
3.4. Pembuatan Pakan Uji
Pakan uji dibuat dengan cara mencampurkan rElGH yang sudah dilakukan penyalutan coating sebelumnya ke dalam pakan. Penyalutan pakan dilakukan
dengan metode seperti yang dilakukan oleh Promdonkoy et al. 2004, menggunakan HP 55 Shinetsu, Japan sehingga terbentuk matriks rElGH-HP55
Gambar 6. HP 55 tersebut memiliki nama dagang Hypromellose Pthalate Hydroxypropylmethylcellulose Pthalate. Profil HP 55 yang digunakan dapat
dilihat pada Lampiran 3.
Gambar 6 Proses penyalutan coating hormon pertumbuhan rekombinan ikan kerapu kertang rElGH dengan menggunakan HP 55 hypromellose
phthalate.
Penyalutan dilakukan dengan mencampurkan pelet protein rElGH yang dilarutkan dalam amonium asetat yang mengandung HP-55 dalam etanol 72,8
menggunakan magnetic stirer. Setelah penyalutan dilakukan, rElGH-HP55
pakan komersial dibuat pasta
ditimbang dan dibentuk
diberikan ke ikan uji
dilakukan pengeringan beku dalam freeze drying. Kemudian rElGH-HP55 disimpan pada suhu ruang hingga akan digunakan.
Setelah dilakukan pencampuran matrik rElGH-rElGH ke dalam pakan, dilakukan analisis proksimat untuk mengklarifikasi kandungan nutrisi pakan
setelah dicampurkan. Komposisi nutrisi pakan yang akan diberikan Tabel 5. Tabel 5 Proksimat dan kandungan energi pakan yang digunakan dalam penelitian
Hasil uji Pakan
Harian Pakan Perlakuan mg rElGHkg pakan
Dosis 0 Dosis 0,3
Dosis 3 Dosis 30
Kadar air 6,29
26,21 25,25
25,63 25,69
Abu 11,4
8,08 8,37
8,72 8,57
Protein 46
33,87 33,48
33,77 33,72
Lemak 5,22
3,99 3,91
3,98 4,05
Serat kasar 3,09
1,78 1,88
1,85 1,86
BETN 28
26,07 27,11
26,05 26,11
GE kkalkg pakan 428,59
341,505 343,28
340,77 341,43
Keterangan: GE Gross Energy dikalkulasi dengan menggunakan koefisien kandungan energi dalam protein
sebesar 5,5 kkalg, lemak 9,5 kkalg, dan karbohidrat 4,5 kkalg. Pakan perlakuan diberikan 2 hariminggu.
Pencampuran rGH-HP55 dengan pakan uji dilakukan dengan cara disemprotkan secara merata. Kemudian pakan uji dikering-anginkan. Pakan uji
yang digunakan berupa pakan komersial yang dihancurkan dalam bentuk tepung untuk dibuat pakan pasta Gambar 7. Pembuatan pakan pasta dilakukan dengan
cara mencampurkan pakan dalam bentuk tepung yang telah diberi rElGH-HP55 sesuai dosisnya dengan komposisi air sebanyak 140-160 dari bobot pakan
tepung Tomiyama Hibiya 1977.
Gambar 7 Proses pembuatan pakan pasta yang mengandung hormon pertumbuhan rekombinan ikan kerapu kertang rElGH.
3.5. Penelitian 1: Penentuan Dosis
