10. Prosedur pelaksanaan toksisitas subkronis
Infusa daun sirih merah Piper crocatum yang merupakan sediaan uji diberikan pada hewan uji sesuai dosis pemberian dengan kekerapan pemberian
satu kali sehari selama 28 hari pada tikus jantan dan betina dengan tetap diberi makan dan minum. Pada awal masa uji yaitu pada hari I, darah semua tikus
diambil melalui sinus orbital mata, Pengambilan darah tersebut dilakukan dengan
menusukkan pipa kapiler langsung ke sinus orbital mata. Sampel darah yang
diambil kemudian ditampung pada Ependorf berisi heparin untuk diambil serum darah, diberi kode kemudian dikirim ke Parahita Medical Lab untuk dilakukan
pengukuran kadar glukosa darah tikus. Pemberian infusa daun sirih merah dilakukan selama 28 hari pada setiap kelompok perlakuan sesuai dengan peringkat
dosis. Pada hari ke-29 darah semua tikus diambil kembali melalui vena orbital mata ditampung pada Ependorf berisi heparin untuk diambil serum darah
kemudian dilakukan kembali pengukuran kadar glukosa darah tikus. Pada hari ke- 29 juga dilakukan pembedahan setengah dari hewan uji baik jantan maupun betina
untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi. Kemudian pada hari ke-42 14 hari setelah hari ke-28 dilakukan pembedahan hewan uji yang tersisa untuk melihat
reversibilitas.
11. Prosedur Pembedahan
Pertama-tama disiapkan pot organ yang yag telah diberi label dan yang sesuai dengan nomor tikus yang akan dibedah dan telah diisi dengan formalin
10 untuk menyimpan organ. Kemudian, menyiapkan alat-alat bedah yang akan digunakan gunting bedah, pinset, papan bedah, pins, beker gelas. Beker gelas
digunakan untuk menampung NaCl 0,9 mencuci organ setelah dibedah. Setelah itu, tikus yang akan dibedah di dislokasi leher terlebih dahulu kemudian posisikan
tikus pada papan bedah menggunakan pins. Bedah dimulai dari bagian perut sampai bagian leher menggunakan gunting bedah. Kemudian, ambil dan pisahkan
masing-masing organ menggunakan gunting bedah dengan bantuan pinset, pastikan tiap-tiap organ tidak tercampur, kemudian organ tersebut dicuci dengan
NaCl 0,9 kemudian dimasukkan ke dalam pot organ yang sesuai antara label tikus yang dibedah dengan label yang ada di pot organ. Sisa organ tikus yang
tidak terpakai dimasukkan ke dalam kantong plastik dan ditutup rapat agar tidak ada bau yang keluar, kemudian di kubur.
12. Pengamatan
a. Pengamatan berat badan hewan uji
Pengamatan berat badan terhadap hewan uji dilakukan dengan cara menimbang hewan uji dengan timbangan. Penimbangan berat badan hewan uji
dilakukan setiap hari. Perhitungan purata berat badan tikus dilakukan dengan cara menambahkan berat badan tikus kemudian dibagi dengan jumlah tikus ditiap
kelompok dilakukan pada hari 0, 7, 14, 21, 28. Kemudian data yang diperoleh dianalisis secara statistik.
b. Pengukuran asupan pakan hewan uji Hewan uji diberikan asupan pakan setiap hari sebanyak 20 g dan
dilakukan penggantian pakan setiap harinya. Cara mengukur besarnya asupan pakan tikus yaitu dengan menghitung selisih berat pakan hari kedua dikurangi
berat pakan pertama. Selisih dihitung dengan menimbang pakan yang diberikan
pada hari pertama, kemudian pada hari kedua pakan yang masih tertinggal pada wadah ditimbang. Selisih penimbangan antara berat pakan hari kedua dengan
berat badan hari pertama inilah yang dihitung sebagai asupan makanan pada hari pertama.
c. Pengukuran asupan minun hewan uji Hewan uji diberikan minum berupa aquadest sebanyak 150 ml. Minuman
diberikan dalam wadah botol kaca yang diberi pipa seperti tabung reaksi yang diberi lubang pada ujungnya. Pengukuran asupan minum hewan uji dilakukan
dengan cara memasukkan 150 ml air pada wadah dihari pertama, kemudian pada hari kedua jumlah sisa air yang masih terdapat dalam botol dihitung. Air minum
yang dihabiskan tikus pada hari pertama dihitung dengan cara mengurangkan jumlah air minum yang diberikan pada hari pertama dengan jumlah air minum
sisa pada hari kedua.
13. Pemeriksaan histopatologis
Pemeriksaan hispatologis dilakukan dengan cara pembedahan untuk diambil organ pankreas. Sebelum melakukan pembedahan, tikus dikorbankan
dengan cara diskolasi leher yaitu mematikan hewan uji dengan cara menarik leher dan ekor secara bersamaan sehingga tulang leher patah. Kemudian dilakukan
pembedahan terhadap tikus. Tikus diletakkan secara terlentang diatas papan pembedahan gabussteroform dan dibedah caesar dengan membuat irisan digaris
tengah ventral tubuh mulai dari area bukaan genitalia hingga ke leher. Rongga perut dan rongga dada dibuka. Setelah pembedahan, diambil organ pankreas untuk
dilakukan pemeriksaan histopatologis. Organ kemudian dicuci bersih dengan aquadest kemudian difiksasi, diletakkan didalam pot yang berisi formalin 10.
14. Histopatologi pankreas
Pembacaannya preparat dilakukan di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada. Perubahan pankreas yang diamati meliputi bagian
endokrin dan bagian eksokrin yang meliputi pulau Langerhans dan sel - sel asinar. Pengamatan dilakukan di bawahmikroskop cahaya pembesaran 400x dengan
bantuan video mikrometer. Pengambilan organ pankreas dengan cara nekropsi setelah tikus mati,
selanjutnya dibuat preparat agar mudah diamati dibawah mikroskop. Pembuatan preparat histopatologi tersebut secara berurutan difiksasi di dalam larutan buffer
netral formalin, trimming, dehidrasi, infiltrasi dengan parafin, diiris dengan mikrotom dan diwarnai dengan hematosilin-eosin HE. Pewarnaan dilakukan
dengan cara menginkubasi preparat otot dengan larutan Mayer’s hematoxilyn, kemudian diinkubasi dalam larutan Eosin 0,5 yang sudah ditambah asam asetat
100 : 1 selama 5 menit.
G. Analisis Data
1 Pemeriksaan kadar glukosa darah Dilakukan uji paired-T test tiap kelompok untuk mengetahui ada
tidaknya perbedaan bermakna sebelum dan sesudah perlakuan. Analisa data kadar glukosa darah dilakukan dengan uji Kolmogorov Smirnov untuk melihat distribusi
data tiap kelompok. Apabila distribusi data normal maka analisis dilanjutkan dengan analisis pola searah One Way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95,
Kategori