Untuk perhitungan kadar air menggunakan metode gravimetri, maka digunakan rumus :
����� ���� −����� ��ℎ�� ����� ����
× 100
5. Penetapan dosis infusa daun sirih merah
Dosis terapi infusa daun sirih merah Piper crocatum adalah 23 g70 Kg BB untuk manusia 70 Kg. Konversi manusia 70 kg ke tikus 200 g = 0,018
Laurence and Bacharach, 1964. Dosis untuk 200g tikus
= 0,018 x 23g
= 0,414g200g BB = 2,07x10
-3
gg BB = 2,07 gKg BB
Dalam penelitian ini dibuat 3 peringkat dosis, dengan cara menggunakan kelipatannya. Angka kelipatan yang digunakan sebesar satu setengah kalinya,
sehingga diperoleh tiga peringkat dosis yaitu 1,38 ; 2,07 ; 3,105 gkgBB.
6. Penetapan dosis aquadest sebagai kontrol negatif
Untuk penentuan dosis aquadest digunakan dosis tertinggi untuk mengetahui jumlah volume maksimum yang diberikan kepada hewan uji. Dosis
tertinggi 3,105 gkgBB, berdasarkan rumus didapatkan volume maksimum yaitu : D x BB =C x V
3,105gKg BB x 200g = 20 x V V = 3,105 ml200g BB
Maka dosis aquadest adalah : V = 0,015525 mlg BB
V = 0,015525 gg BB karena 1ml aquadest sama dengan 1g V = 15,525 gKg BB
7. Pembutan infusa daun sirih merah
Dalam pembuatan infusa, sebanyak 20 g serbuk kering daun sirih merah Piper crocatum ditimbang dan dicampur dengan 100 ml aquadest. Campuran ini
dipanaskan selama 15 menit dengan suhu 90 C pada heater waktu terhitung dari
suhu campuran telah mencapai 90 C. Air yang diperoleh kemudian disaring
menggunakan kain flanel dan ditambahkan aquadest hingga 100 ml. Konsentrasi infusa yang didapat adalah 20.
8. Penyiapan hewan uji
Hewan uji yang digunakan berjumlah 40 ekor, terdiri dari tikus jantan dan betina, galur Wistar, umur 2- 3 bulan, berat badan 100 – 200 g. Ditempatkan
dalam metabolic cage. Pada setiap metabolic cage berisi satu tikus. Sebelum dilakukan perlakuan hewan uji diadaptasikan pada metabolic cage selama 3 hari.
9. Pengelompokan hewan uji
Tikus sebanyak empat puluh ekor yang digunakan dalam penelitian, dibagi menjadi empat kelompok secara acak, yaitu tiga sebagai kelompok
perlakuan dan satu kelompok perlakuan yang masing – masing kelompok terdiri dari sepuluh ekor tikus lima jantan dan lima betina. Pada kelompok satu
merupakan kelompok kontrol negatif dengan pemberian aquadest dengan dosis 15,252 gKgBB sedangkan kelompok II hingga IV diberikan perlakuan infusa
daun sirih merah Piper crocatum dengan peringkat dosis berturut – turut, yaitu 1,38 ; 2,07 ; 3,105 gKgBB tikus.
10. Prosedur pelaksanaan toksisitas subkronis
Infusa daun sirih merah Piper crocatum yang merupakan sediaan uji diberikan pada hewan uji sesuai dosis pemberian dengan kekerapan pemberian
satu kali sehari selama 28 hari pada tikus jantan dan betina dengan tetap diberi makan dan minum. Pada awal masa uji yaitu pada hari I, darah semua tikus
diambil melalui sinus orbital mata, Pengambilan darah tersebut dilakukan dengan
menusukkan pipa kapiler langsung ke sinus orbital mata. Sampel darah yang
diambil kemudian ditampung pada Ependorf berisi heparin untuk diambil serum darah, diberi kode kemudian dikirim ke Parahita Medical Lab untuk dilakukan
pengukuran kadar glukosa darah tikus. Pemberian infusa daun sirih merah dilakukan selama 28 hari pada setiap kelompok perlakuan sesuai dengan peringkat
dosis. Pada hari ke-29 darah semua tikus diambil kembali melalui vena orbital mata ditampung pada Ependorf berisi heparin untuk diambil serum darah
kemudian dilakukan kembali pengukuran kadar glukosa darah tikus. Pada hari ke- 29 juga dilakukan pembedahan setengah dari hewan uji baik jantan maupun betina
untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi. Kemudian pada hari ke-42 14 hari setelah hari ke-28 dilakukan pembedahan hewan uji yang tersisa untuk melihat
reversibilitas.
11. Prosedur Pembedahan
