Teknik Pemisahan Teknik Spektroskopi

2.3. Teknik Pemisahan

Tujuan dari teknik pemisahan adalah untuk memisahkan komponen yang akan ditentukan berad dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen-komponen lainnya. Ada 2 jenis teknik pemisahan : 1. Pemisahan Kimia Pemisahan ini berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifat fisika komponen dalam campuran yang akan dipisahkan. 2. Pemisahan Fisika Pemisahan ini berdasarkan pada perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-sifat fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam suatu golongan. Muldja, 1995.

2.4. Kromatografi

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara 2 fase, satu dari fase-fase ini membentuk lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat. Fase stasioner mungkin suatu zat padat atau suatu cairan dan fase yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu fase gas. Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fase diam, yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fase diam berupa zat padat disebut kromatografi serapan, jika berupa zat cair atau gas maka ada empat macam system kromatografi yaitu : 1. Fase gerak cair-fase diam padat kromatografi serapan a. Kromatografi Lapis Tipis b. Kromatografi Penukar Ion 2. Fase gerak gas-fase diam padat, yakni kromatografi gas padat 3. Fase gerak cair-fase diam cair kromatografi partisi, yakni kromatografi kertas 4. Fase gerak gas-fase diam zat cair, yakni : a. Kromatografi Gas-Cair b. Kromatografi Kolom Kapiler Universitas Sumatera Utara Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa senyawa- senyawa yang dipisahkan terdistribusi diantara fase gerak dan fase diam dalam perbandingan yang sangat berbeda-beda dari suatu senyawa terhadap senyawa yang lain. Sastrohamidjojo, 1991.

2.4.1. Kromatografi Lapis Tipis

Teknik kromatografi lapis tipis KLT dikembangkan oleh Egon Stahl dengan menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan lapisan tipis. KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat juga merupakan kromatografi partisi karena bahan penyerap telah dilapisi air dari udara. Sistem ini segera popular karena memberikan banyak keuntungan, misalnya peralatan yang diperlukan sedikit, murah, sederhana, waktu, analisis cepat dan daya pisah cukup baik. Sudjadi, 1986

2.4.1.1 Pembuatan Lapisan Tipis

Dalam pembuatan lapisan tipis digunkan plat-plat kaca yang memiliki ukuran 20 x 5 cm atau 20 x 20 cm, dan ukuran ini dianggap “standart”. Plat ini dicuci terlebih dahulu dengan air dan detergen kemudian dikeringkan dengan aseton. Selanjutnya membuat penyerap menjadi bubur dengan air, biasanya dalam perbandingan x gram penyerap dan 2x ml air. Bubur diaduk dengan baik dan dibentangkan di atas plat kaca dengan berbagai cara. Tebal “standart” adalah 250 mikron. Lapisan-lapisan yang lebih tebal 0,5 – 2,0 mm digunakan untuk pemisahan-pemisahan yang sifatnya besar, dengan menggunakan penyerap hingga 250 mg untuk plat dengan ukuran 20 x 20 cm. Salah satu keukaran dengan lapisan tebal ialah adanya tendensi mengelupas bila kering.Sastrohamidjojo, 1985 Beberapa contoh penyerap yang digunakan untuk pemisahan dalam kromatografi lapis tipis adalah sebagai berikut : Universitas Sumatera Utara

1. Silika gel

Ada beberapa jenis silika gel, yaitu : a. Silika gel G Silika gel G adalah silika gel yang mengandung 13 kalsium sulfat sebagai perekat. Jenis silika gel ini biasanya mengandung ion logam, terutama ion besi. Kandungan ion besi dapat dihilangkan dengan mengembangkan plat TLC silika gel G dengan sstem pelarut metanol : asam HCl pekat 9 : 1. b. Silika gel H Perbedaan silika gel G dan silika gel H ialah, bahwa silika gel H tidak menngandung perekat kalsium sulfat. Silika gel H dipakai untuk pemisahan yang bersifat spesifik, terutama lipida netral. c. Silika gel PF Jenis silika gel ini diketemukan belakangan, yang dibuat sedemikian rupa sehingga senyawa-senyawa organik terikat pada plat ini dapat mengadakan fluoresensi. Oleh karena itu visualisasinya dapat dikerjakan dengan menempatkan plat yang telah dikembangkan di dalam ruangan gelap atau dengan sinar ultra violet yang bergelombang pendek.

2. Alumina

Penggunaan alumina dalam TLC, yang semula diperkenalkan oleh peneliti dari Cekoslowakia, tidak sesering silika gel. Sebenarnya alumina netral mempunyai kemampuan untuk memisahkan bermacam-macam senyawa, seperti terpena, alkaloid, steroid, dan senyawa-senyawa alisklik, alifatik, serta aromatik. Sebagai zat perekat alumina tidak mengandung zat perekat, memepunyai sifat alkalis dan dapat digunakan baik tanpa maupun dengan aktivasi. Universitas Sumatera Utara

3. Kieselguhr

Kieselguhr merupakan adsorben yang lebih lemah dari silika gel dan alumina, oleh karena itu lebih cocok untuk memisahkan senyawa-senyawa polar. Adnan, M., 1997 Nilai utama KLT pada penelitian flavonoid ialah sebagai cara analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit. Menurut Markham, KLT memiliki peranan penting dalam metoda pemisahan dan isolasi yaitu : a. Mencari pelarut untuk kromatografi kolom b. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom c. Menyigi arah atau perkembangan reaksi seperti hidrolisis atau metilasi d. Identifikasi flavonoida secara ko-kromatografi e. Isolasi flavonoida murni skala kecil.

2.4.2. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom atau tabung merupakan salah satu jenis pemisahan dengan menggunakan prinsip aliran zat cair pelarut yang dipengaruhi oleh gaya tarik bumi gravitasi bumi atau dikenal dengan sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut.Gritter, 1991 . Pada isolasi flavonoida sebaiknya digunakan kolom skala besar karena hal ini dapat meningkatkan proses pemisahan yang baik. Pada dasarnya cara ini meliputi penempatan campuran flavonoida berupa larutan di atas kolom yang berisi serbuk penyerap seperti selulose, silika, atau poliamida, dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang cocok. Kolom yang digunakan umumnya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan keran pada salah satu ujung, dan ukurannya sedemikian rupa sehingga nisbah garis tengah terhadap panjang kolom dalam rentang 1:10 sampai 1:30. Kemasan kolom harus dipilih dari jenis yang dipasarkan khusus untuk kromatografi kolom karena ukuran partikel penting. Jika ukuran partikel terlalu kecil, laju aliran pengelusi mungkin terlalu lambat, sedangkan bila terlalu besar, mungkin pemisahan komponen secara Universitas Sumatera Utara kromatografi tidak baik. Kemasan niaga biasanya dalam ukuran 100-300mesh.  Selulosa Markham, 1988

2.4.2.1. Pengisian Kolom

Pengisian kolom harus dikerjakan dengan seragam.Setelah adsorben dimasukkan dapat diseragamkan kepadatannya dalam kolom dengan menggunakan vibrator atau dengan plunger pemadat. Selain itu dapat juga dikerjakan dengan memasukkan adsorben dalam bentuk larutan slurry dan partikelnya dibiarkan mengendap. Pengisian kolom yang tidak seragam akan menghasilkan rongga-rongga di tengah-tengah kolom. Cara untuk mengatasi masalah ini adalah dengan mengadakan back fushing , sehingga terjadi pengadukan, yang seterusnya dibiarkan lagi mengendap. Pada bagian bawah dasar dan atas dari isian kolom diberi wol kaca glass wool atau sintered glass disc untuk menyangga isian. Bila kolom telah diberi bahan isian, permukaan cairan tidak boleh dibiarkan turun dibawah permukaan bahan isian bagian atas, karena akan memberikan peluang masuknya gelembung udara masuk ke kolom. Adnan,M., 1997

2.4.2.2. Memilih Kemasan Kolom

Kemasan kolom yang tersedia sangatlah banyak dan senarai di bawah memberikan pedoman mengenai pemakaian dan cirri sejumlah jenis kemasan yang berguna. Pemakaian selulosa serupa dengan kertas, yaitu ideal untuk memisahkan glikosida yang satu dengan yang lain, atau memisahkan glikosida dari aglikon, serta untuk memisahkan aglikon yang kurang polar. Kapasitasnya rendah.  Silika Bahan ini paling berguna untuk memisahkan aglikon yang kurang polar, misalnya isoflavon, flavanon, metal flavon, dan flavanol. Kapasitas pertengahan. Universitas Sumatera Utara  Poliamida Bahan ini cocok untuk memisahkan semua flavonoid, meski juga ideal untuk memisahkan glikosida. Merupakan pelengkap untuk KKt karena melibatkan penyerap dan pengembang yang berlainan. Sebelum dipakai harus dicuci dengan MeOH dan H 2 O agar poliamida yang larut tidak mencemari semua fraksi. Kapasitas tinggi.  Gel sephadex deret G Bahan ini dirancang untuk memisahkan campuran, terutama berdasarkan pada ukuran molekul bila digunkan pelarut air; molekul besar terlebih dahulu. Sephadex berguna untuk memisahkan poliglikosida yang berbeda bobot molekulnya. Kapasitasnya lebih besar karena ukurannya lebih teratur.

2.4.3. Kromatografi Preparatif

Salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan yang paling murah dan memakai peralatan yang paling dasar ialah kromatografi lapis titpis preparatif KLTP. Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan alam dalam jumlah gram, sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram. KLTP bersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka, masih dijumpai dalam sebagian besar publikasi mengenai isolasi bahan alam, terutama dari laboratorium yang tidak dilengkapi dengan cara pemisahan modern. Akan tetapi, seperti yang akan diterangkan kemudian, tertdapat banyak masalah pada KLTP.  Penyerap Dalam KLTP digunakan ketebalan adsorbent yang paling sering dipakai yaitu 0,5-2 mm. ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm. Peneyerap yang paling umum ialah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil.  Penotolan Cuplikan Universitas Sumatera Utara Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada plat KLTP. Pelarut yang baik ialah pelarut atsiriorganik heksana, diklorometana, etil asetat, karena jika pelarut kurang atsiri maka akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10.  Pemilihan Fase Gerak Pilihan pelarut ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan memakai KLT analitik. Karena ukuran partikel penyerap kira-kira sama, pelarut yang dipakai pada plat KLT dapat dipakai langsung pada KLTP. Pengembangan pelat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat.  Isolasi senyawa yang sudah terpisah Kebanyakan penyerap KLTP mengandung indikator fluoresensi yang membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap sinar UV. Akan tetapi, beberapa indikator menimbulkan masalah yaitu bereaksi dengan asam kadang-kadang bahakan dengan asam asetat. Untuk senyawa yang tidak menyerap sinar UV, ada beberapa pilihan : a. Menyemprot dengan air misalnya saponin b. Menutup pelat dengan sepotong kaca menyemprot salah satu sisi dengan pereaksi semprot c. Menambahkan senyawa pembanding. Hostettman,K.,1995

2.4.4. Harga Rf Retension factor

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi warna. Lazimnya identifikasi menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Universitas Sumatera Utara Dapat didefenisikan sbb : Harga Rf = Faktor-faktor yang memepengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapis tipis yang juga mempengaruhi harga Rf : 1. Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan 2. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya 3. Tebal keraataan dari lapisan penyerap 4. Pelarut dan derajat kemurniannya fasa gerak 5. Derajat kejenuhan dari uap 6. Jumlah cuplikan yang digunakan 7. Suhu 8. Kesetimbangan 9. Teknik percobaan Sastrohamidjojo, 1985

2.4.5. Ekstraksi

Ekstraksi dapat dilakukan pada bahan tumbuhan yang akan diisolasi. Umumnya kita perlu ‘membunuh’ jaringan tumbuhan untuk mencegah terjadinya oksidasi enzim atau hidrolisis. Mencelupkan jaringan daun segar atau bunga, bila perlu dipotong-potong,. Kedalam etanol mendidih adalah salah satu cara yang baik untuk mencapai tujuan. Selanjutnya, bahan dapat dimaserasi dalam suatu pelumat, lalu disaring. Bila mengisolasi senyawa dari jaringan hijau, keberhasilan ekstraksi dengan alkohol berkaitan langsung dengan seberapa jauh klorofil tertarik oleh pelarut itu. Bila ampas jaringan, pada ekstraksi ulang, sama sekali tak berwarna hijau lagi, dapat dianggap semua senyawa berbobot molekul rendah telah terekstraksi. Harborne, 1987 Universitas Sumatera Utara

2.5. Teknik Spektroskopi

Teknik spektroskopi adalah salah satu teknik analisis kimia-fisika yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik. Ada dua macam instrumen pada teknik spektroskopi yaitu spektrometer dan spektrofotometer. Instrumen yang memakai monokromator celah tetap pada bidang fokus disebut sebagai\ spektrometer. Apabila spektrometer tersebut dilengkapi dengan detektor yang bersifat fotoelektrik maka disebut spektrofotometer. Muldja, 1955 Informasi Spektroskopi Inframerah menunjukkan tipe-tipe dari adanya gugus fungsi dalam suatu molekul dan Resonansi Magnetik Inti yang memberikan informasi tentang bilangan dari setiap tipe dari atom hidrogen dan juga memberikan informasi yang menyatakan tentang lingkungan dari setiap tipe dari atom hidrogen. Kombinasinya dan data yang ada kadang-kadang menentukan struktur yang lengkap dari molekulnya yang tidak diketahui. Pavia, 1979

2.5.1. Spektroskopi Ultra Violet-Visible

Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel. Sinar ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan electron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektroskopi UV-Vis biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks di dalam larutan. Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800 nm. Dachriyanus, 2004 Spektrum flavonoida bisanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut methanol MeOH, AR atau yang setara atau etanol EtOH, meski perlu diingat bahwa spektrum yang dihasilkan dalam etanol kurang memuaskan. Spektrum khas terdiri atas dua maksimal pada rentang 240 – 285 nm pita II dan 300-550 nm pita I. Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksimal tersebut memebrikan informasi Universitas Sumatera Utara yang berharga mengenai sifat flavonoida dan pola oksigenasinya. Ciri khas spektrum tersebut ialah kekuatan nisbi yang rendah pada pita I dalam dihidroflavon, dihidroflavonol, dan isoflavon serta kedudukan pita I pada spektrum khalkon, auron, dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang tinggi. Tabel Rentangan serapan spektrum UV-tampak flavonoida Pita II nm Pita I nm Jenis flavonoida 250-280 250-280 250-280 245-275 275-295 230-270 kekuatan rendah 230-270 kekuatan rendah 270-280 310-350 330-360 350-385 310-330 bahu kira- kira 320 puncak 300-330 bahu 340-390 380-430 465-560 Flavon Flavonol 3-OH tersubstitusi Flavonol3-OH bebas Isoflavon Isoflavon 5-deoksi-6,7-deoksigenasi Flavanon dan dihidroflavanol Khalkon Auron Antosianidin dan antosianin Markham, 1988 Dibawah ini daftar beberapa pengaruh substituent untuk senyawa aromatik. Hal ini dapat menjadi catatan bahwa ion phenoxide -O - , yang dapat dijunpai dalam larutan basa senyawa fenol, dimana dapat menyerap panjang gelombang yang lebih panjang dari pada senyawa induk fenol -OH. Secara umum menyumbangkan elektron dan substituent pasangan sunyi lone pair yang dapat menyebabkan pergeseran kimia berwarna merah dan penyerapan yang lebih tinggi. Senyawa kompleks memiliki pergeseran kimia yang meningkat saat ada sejumlah lebih substituent yang terikat. Universitas Sumatera Utara Tabel. Absorbsi max untuk beberapa monosubstitusi benzene Ph-R methanol : air R λ maksimum nm -H 204 – 254 -CH 3 207 – 261 -Cl 210 – 264 -OH 211 – 270 -OCH 3 217 – 269 -CO 2 - 224 – 271 -COOH 230 – 280 -NH 2 230 – 280 -O - 235 – 287 Kealey,D. 2002 Absorbsi radiasi UV oleh senyawa aromatik yang terdiri dari cincin benzene terpadu bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang dengan bertambah banyaknya cincin itu karena bertambahnya konjugasi dan membesarnya stabilisasi-resonansi dari keadaan eksitasi. Daerah yang paling berguna dari spektrum UV adalah daerah dengan panjang gelombang di atas 200 nm. Dalam absorbsi yang ditimbulkan oleh senyawa aromatik dihasilkan warna dalam spektrum tampak. Warna merupakan hasil dari suatu perangkat kompleks dari respons faali maupun psikologis terhadap panjang gelombang cahaya antara 400-750 nm, yang jatuh pada selaput jala. Tabel. Warna dalam spektrum tampak λ maks nm Warna Warna komplementersubstraksi 400-424 Ungu Hijau-kuning 424-491 Biru Kuning 491-570 Hijau Merah 570-585 Kuning Biru 585-647 Jingga Hijau-biru 647-700 Merah Hijau Fessenden,F. 1986 Universitas Sumatera Utara Tabel Pita absorbsi UV dari flavonoida No. Jenis Flavonoida Struktur Umum Pita II Pita I 1. Flavon 7 8 O O 6 5 10 9 1 2 1 2 6 5 4 3 4 3 240-285 304-350 2. Flavonol O O OH 240-285 352-390 3. Flavanon O O 270-295 300-350 4. Dihidroflavonol O O OH R 2 R 1 270-295 300-320 5. Khalkon O 220-270 340-390 6. Auron O O HC 220-270 370-430 7. Antosianidin O OH 270-280 465-550 Sujata,V., 2005 Universitas Sumatera Utara

2.5.2. Spektrofotometri Infra Merah FT-IR

Radiasi infra merah ditemukan oleh Sir William Hercshel pada tahun 1880, yang melaporkan penemuannya kepada Royal Society. Pada waktu itu para saintis belum memahami secara jelas keadaan transisi. Daerah inframerah terletak antara spektrum electromagnetic cahaya tampak dan spektrum radio; yakni antara 4.000-400 cm -1 . Mulai tahun 1903 William dan N. Coblentz mahasiswa di Cornel University memperbaiki teknik-teknik percobaan dan menyusun sederetan spectra serapan zat murni.

a. Ada beberapa daerah penyerapan terpenting dalam Spektrum Infra Merah :