Alat – alat Bahan Penelitian Prosedur Penelitian

BAB 3 METODA PENELITIAN

3.1. Alat – alat

1. Gelas ukur 50 ml Pyrex 2. Gelas beaker 250 ml Pyrex 3. Gelas beaker 1000 ml Pyrex 4. Corong saring 5. Corong pisah 1000 ml Pyrex 6. Kolom kromatografi d = 5 cmp = ±87 cm Pyrex 7. Tabung reaksi Pyrex 8. Plat skrining 9. Neraca analitis Mettler PM 480 10.Hair Dryer Miyako 11.Rotari evaporator Buchi B-480 12.Labu alas 500 ml Pyrex 13.Plat KLT 14.Plat KLTP Preparatif d = 0,25 mm p.a E.merck 15.Statif dan klem 16.Lampu UV 254 nm 17.Spatula 18.Batang pengaduk 19.Pipet tetes 20.Botol vial 21.Bejana Chamber 22.Pipa Kapiler 23.Spektrofotometer FT-IR Jasco 24.Spektrofotometer NMR-H 1 500 MHz 25.Spektrofotometer UV-Vis 26.Botol Perendaman 5000 ml Pyrex 27.Water Bath 28.Kapas Universitas Sumatera Utara

3.2. Bahan Penelitian

1. Serbuk kering kulit Buah Jengkol 2. Metanol Destilasi 3. n-Heksana Teknis 4. Kloroform p.a Merck 5. Aseton p.a Merck 6. Etanol Teknis 7. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM 8. Reagent Feri Klorida 1 9. Reagent Natrium Hidroksida 10 10. Reagent Mg-HCl 11. Reagent H 2 SO4 p

3.3. Prosedur Penelitian

3.3.1. Penyedian Sampel

Sampel yang diteliti adalah kulit buah Tumbuhan Jengkol yang diperoleh dari Pasar Central,Medan. Kulit Buah Tumbuhan Jengkol dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk sebanyak 1900 gram.

3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Kulit Buah Tumbuhan Jengkol

Serbuk kulit buah Tumbuhan Jengkol diidentifikasi dengan menggunakan cara : 1. Uji busa 2. Skrining Fitokimia 3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis Universitas Sumatera Utara

3.3.2.1. Uji Busa

Serbuk kulit buah tumbuhan Jengkol sebanyak 5 g dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian ditambah 10 ml akuades dan dipanaskan pada penangas air. Lalu dikocok-kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 10 menit. Ternyata busa hilang yang membuktikan bahwa didalam kulit buah tumbuhan Jengkol tidak terdapat senyawa glikosida.

3.3.2.2. Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada kulit buah tumbuhan Jengkol maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif. Serbuk kulit diekstraksi maserasi dengan metanol, lalui disaring. Filtrat yang diperoleh ditampung dan diteteskan pada plat skrining untuk diuji dengan pereaksi H 2 SO 4P , NaOH 10, FeCl 3 1 dan MgHCl kemudian diperhatikan perubahan warna yang terjadi terhadap ekstrak sampel.

3.3.2.3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak aseton dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F 254 . Fasa gerak yang digunakan adalah campuran CHCl 3 : MeOH dengan perbandingan 90 : 10 v v ; 80 : 20 v v ; 70 : 30 v v . Prosedur analisis kromatografi lapis tipis : Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak CHCl 3 : MeOH dengan perbandingan 90 : 10 v v kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat methanol pada plat KLT. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari dalam bejana, lalu dikeringkan. Diamati warna bercak yang dihasilkan dibawah sinar Ultra Violet dengan λ = 254 nm dan dihitung harga Rf-nya, selanjutnya dimasukkan kedalam botol pereaksi FeCl 3 1. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut CHCl 3 : MeOH 80 : 20 v v ; 70 : 30 v v. Dari analisis KLT Universitas Sumatera Utara menunjukkan bahwa di dalam kulit buah tumbuhan Jengkol terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak CHCl 3 : MeOH 80 : 20 v v . Harga Rf dapat dilihat pada kromaatogram Lampiran C 3.3.3. Prosedur untuk memperoleh senyawa kimia dari Ekstrak Kulit Buah Tumbuhan Jengkol Serbuk kulit buah tumbuhan Jengkol ditimbang sebanyak 1900 g, dimasukkan kedalam botol perendaman dan ditambahkan pelarut methanol yang telah didestilasi sampai semua serbuk terendam oleh pelarut dan dibiarkan selama ± 72 jam dan sesekali diaduk. Maserat ditampung dan diperoleh ekstrak berwarna hijau. Maserasi dilakukan berulang kali dengan menggunakan pelarut methanol sampai ekstrak methanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negative pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoid. Ekstrak methanol yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator pada suhu ± 63 o C sehingga diperoleh ekstrak pekat methanol, kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksana sebanyak ± 7 kali, sehingga terbentuk lapisan n-heksana dan lapisan methanol. Fraksi metanol ditampung dan dipekatkan, dan dilakukan kemudian dilarutkan dengan aseton. Dilakukan skrining fitokimia dengan pereaksi yang menghasilkan uji positif dengan peraksi. Selanjutnya dipekatkan sampai diperoleh ekstrak pekat aseton sebanyak ± 8,3 gram.

3.3.4. Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat aseton kulit buah Tumbuhan Jengkol yang tealh diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230 mesh ASTM dan fase gerak adalah campuran pelarut CHCl 3 : MeOH dengan perbandingan 80 : 20 v v . Prosedur isolasi senyawa flavonoid dengan kromatografi kolom : Universitas Sumatera Utara Dirangkai alat kromatografi kolom. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel dicampur dengan ekstrak pekat aseton dengan menggunakan pelarut n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan kloroform 100 hingga silika gel padat dan tidak menghasilkan gelembungbubblepatahan. Lalu ditambahkan fase gerak CHCl 3 : MeOH mulai dari 90 : 10 v v ; 80 : 20 v v ; 70 : 30 v v. secara perlahan-lahan dan diatur aliran fase gerak yang keluar dari kolom sama banyaknya denga setiap penambahan fase gerak dengan ratio yang berbeda dari atas kolom. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 25 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama. Setelah itu diuji flavonoida dan diuapkan sampai pelarutnya habis sehingga terbentuk kristal.

3.3.5. Pemurnian

Senyawa yang diperoleh dari fraksi yaitu pada fraksi 30 – 51 dilakukan pemurnian senyawa atau pemurnian untuk memastikan kemurniannya. Prosedur : Senyawa pada fraksi 30 – 51 dipreparatif dengan menggunakan KLT Preparatif. Senyawa tersebut ditotolkan dengan menggunakan pipa kapiler ke plat preparatif pada batas bawah dengan jarak 2 cm, kemudian dimasukkan kedalam chamber untuk di elusi dengan menggunakan perbandingan campuran eluent n-heksan dan aseton 120 : 80 v v. Dielusi selama ± 2 jam selanjutnya dikeringkan plat dan dilihat kenaikan noda dibawah lampu UV dengan panjang gelombang lampu yang berbeda, dilakukan penggerusan dan diambil senyawa dengan jarak noda yang sama, dilakukan pelarutan dengan menggunakan campuran eluent CHCl 3 : MeOH 120 : 180 v v . ditampung dan dilakukan rekristlalisasi dengan menggunakan campuran eluent etanol : n-heksan sebanyak ± 6 kali. Universitas Sumatera Utara

3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Kromatografi dengan KLT

Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis dengan menggunakan fase diam silika gel 60 F 254 dengan fase gerak CHCl 3 : MeOH 80 : 20 v v . Prosedur : Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak kedalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fase gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi Feri Klorida 1 menghasilkan bercak hitam yang menunjukkan uji positif adanya senyawa flavonoida. Perlakuan yang sama dilakukan, dan difiksasi dengan Natrium Hidroksida 10 yang menghasilkan bercak berwarna biru violet. Lampiran D

3.3.7. Analisis spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi

3.3.7.1. Analisis Senyawa Hasil Isolasi dengan Spektrofotometer UV-Vis

Analisis ini dilakukan di Pusat Penelitian Kimia-LIPI, Serpong-Tangerang Lampiran E

3.3.7.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi dengan Spektrofotometer FT-IR

Analisis ini dilakukan di Pusat Penelitian Kimia-LIPI, Serpong-Tangerang Lampiran F

3.3.7.3. Analisis Senyawa Hasil Isolasi dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton

1 H-NMR Analisis ini dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI Serpong – Tangerang dengan menggunakan DMSO-d 6 sebagai pelarut dan TMS sebagai standart dalam spektrum absorbansi antara 0 – 14 ppm dibawah TMS. Lampiran H Universitas Sumatera Utara

3.4. Bagan Skrining Fitokimia