Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada plat KLTP. Pelarut yang baik ialah pelarut atsiriorganik heksana, diklorometana, etil
asetat, karena jika pelarut kurang atsiri maka akan terjadi pelebaran pita.
Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10.
Pemilihan Fase Gerak
Pilihan pelarut ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan memakai KLT analitik. Karena ukuran partikel penyerap kira-kira sama, pelarut yang
dipakai pada plat KLT dapat dipakai langsung pada KLTP. Pengembangan pelat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung
beberapa plat.
Isolasi senyawa yang sudah terpisah
Kebanyakan penyerap KLTP mengandung indikator fluoresensi yang membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang
dipisahkan menyerap sinar UV. Akan tetapi, beberapa indikator menimbulkan masalah yaitu bereaksi dengan asam kadang-kadang bahakan dengan asam
asetat. Untuk senyawa yang tidak menyerap sinar UV, ada beberapa pilihan :
a. Menyemprot dengan air misalnya saponin b. Menutup pelat dengan sepotong kaca menyemprot salah satu sisi dengan
pereaksi semprot c. Menambahkan senyawa pembanding. Hostettman,K.,1995
2.4.4. Harga Rf Retension factor
Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi warna. Lazimnya identifikasi
menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas.
Universitas Sumatera Utara
Dapat didefenisikan sbb : Harga Rf =
Faktor-faktor yang memepengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapis tipis yang juga mempengaruhi harga Rf :
1. Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan 2. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya
3. Tebal keraataan dari lapisan penyerap 4. Pelarut dan derajat kemurniannya fasa gerak
5. Derajat kejenuhan dari uap 6. Jumlah cuplikan yang digunakan
7. Suhu 8. Kesetimbangan
9. Teknik percobaan Sastrohamidjojo, 1985
2.4.5. Ekstraksi
Ekstraksi dapat dilakukan pada bahan tumbuhan yang akan diisolasi. Umumnya kita perlu ‘membunuh’ jaringan tumbuhan untuk mencegah terjadinya oksidasi enzim atau
hidrolisis. Mencelupkan jaringan daun segar atau bunga, bila perlu dipotong-potong,. Kedalam etanol mendidih adalah salah satu cara yang baik untuk mencapai tujuan.
Selanjutnya, bahan dapat dimaserasi dalam suatu pelumat, lalu disaring. Bila mengisolasi senyawa dari jaringan hijau, keberhasilan ekstraksi dengan alkohol
berkaitan langsung dengan seberapa jauh klorofil tertarik oleh pelarut itu. Bila ampas jaringan, pada ekstraksi ulang, sama sekali tak berwarna hijau lagi, dapat dianggap
semua senyawa berbobot molekul rendah telah terekstraksi. Harborne, 1987
Universitas Sumatera Utara
2.5. Teknik Spektroskopi
Teknik spektroskopi adalah salah satu teknik analisis kimia-fisika yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik. Ada dua macam
instrumen pada teknik spektroskopi yaitu spektrometer dan spektrofotometer. Instrumen yang memakai monokromator celah tetap pada bidang fokus disebut
sebagai\ spektrometer. Apabila spektrometer tersebut dilengkapi dengan detektor yang bersifat fotoelektrik maka disebut spektrofotometer. Muldja, 1955
Informasi Spektroskopi Inframerah menunjukkan tipe-tipe dari adanya gugus fungsi dalam suatu molekul dan Resonansi Magnetik Inti yang memberikan informasi
tentang bilangan dari setiap tipe dari atom hidrogen dan juga memberikan informasi yang menyatakan tentang lingkungan dari setiap tipe dari atom hidrogen.
Kombinasinya dan data yang ada kadang-kadang menentukan struktur yang lengkap dari molekulnya yang tidak diketahui. Pavia, 1979
2.5.1. Spektroskopi Ultra Violet-Visible
Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel. Sinar
ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan electron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektroskopi UV-Vis
biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks di dalam larutan. Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan sinar tampak
berada pada panjang gelombang 400-800 nm. Dachriyanus, 2004
Spektrum flavonoida bisanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut methanol MeOH, AR atau yang setara atau etanol EtOH, meski perlu diingat
bahwa spektrum yang dihasilkan dalam etanol kurang memuaskan. Spektrum khas terdiri atas dua maksimal pada rentang 240 – 285 nm pita II dan 300-550 nm pita I.
Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksimal tersebut memebrikan informasi
Universitas Sumatera Utara
