Linieritas Validasi Metode HPLC

17

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Persiapan Sampel

Persiapan sampel dilakukan dengan mendata sebanyak-banyaknya minuman bubuk berbasis kedelai yang dijual di pasaran di seluruh Indonesia melalui internet dan mendatangi supermarket serta apotek di daerah Bogor, Semarang, dan Jakarta. Pada tahap tersebut diperoleh sebanyak 33 sampel. Tahap selanjutnya adalah mensurvei keberadaan produk-produk tersebut di pasaran. Survei dilakukan di supermarket dan apotek di wilayah Bogor, Semarang, dan Jakarta. Tiga belas sampel akhirnya tidak dipilih karena sulit dijumpai di pasaran pembelian harus melalui pemesanan terlebih dahulu sehingga akhirnya tersisa dua puluh sampel yang digunakan pada penelitian. Kedua puluh sampel tersebut kemudian digolongkan berdasarkan usia konsumen dan informasi pada label kemasan. Berdasarkan usia konsumen, sampel digolongkan menjadi konsumen diatas 3 tahun, 1-3 tahun, dan 0-1 tahun. Kemudian berdasarkan informasi pada label kemasan, konsumen usia diatas 3 tahun dibagi lagi menjadi konsumen golongan khusus dan konsumen biasa. Golongan khusus pada penelitian ini adalah sampel yang ditujukan untuk orang yang sedang berdiet dan balita yang sedang dalam masa pertumbuhan. Informasi tersebut diperoleh dari keterangan pada label kemasan. Sampel yang ditujukan untuk konsumen biasa sebanyak 8 sampel, konsumen khusus sebanyak 5 sampel, konsumen usia 1-3 tahun sebanyak 2 sampel, dan konsumen usia 0-1 tahun sebanyak 5 sampel. Daftar komposisi kedua puluh sampel pada penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 5.

B. Validasi Metode HPLC

1. Linieritas

Linieritas menunjukkan kemampuan metode analisis untuk memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam zat uji pada kisaran konsentrasi tertentu AOAC, 2002. Uji linieritas dilakukan dengan cara membuat kurva hubungan antara konsentrasi standar dengan luas area yang dihasilkan. Larutan standar yang digunakan adalah rafinosa dan stakiosa dengan enam konsentrasi yang berbeda. Konsentrasi yang digunakan pada standar rafinosa adalah 2.16, 2.89, 4.33, 5.77, 6.50, dan 8.66 mgml sedangkan pada stakiosa adalah 2.19, 2.92, 4.38, 5.83, 6.58, dan 8.77 mgml. Linieritas dinyatakan dalam koefisien korelasi r 2 dari tiga ulangan yang dilakukan. Penentuan linieritas dilakukan sebanyak tiga kali ulangan, sehingga diperoleh regresi linier dari rerata luas area ketiga ulangan tersebut. Berdasarkan hasil pengujian dengan tiga kali ulangan, diperoleh kurva standar untuk rafinosa adalah y = 114977x + 70799 dengan koefisien korelasi r 2 sebesar 0.998 Gambar 4. Menurut Papadoyannis dan Samanidou 2005, nilai koefisien korelasi yang baik pada validasi metode HPLC adalah berkisar antara 0.98-1.00 atau lebih dari 0.99, sehingga dapat dikatakan bahwa linieritas pada standar rafinosa telah memenuhi persyaratan metode yang baik. Nilai koefisien korelasi yang tinggi menunjukkan hubungan yang linear antara sinyal detektor yang terukur dengan konsentrasi rafinosa atau stakiosa yang ada dalam contoh. Nilai kemiringan garis menyatakan sensitifitas suatu metode. Nilai kemiringan garis yang besar menunjukkan bahwa perubahan konsentrasi yang kecil sangat berpengaruh terhadap sinyal detektor yang dihasilkan, sehingga metode dapat dikatakan memiliki sensitifitas yang sangat baik. Nilai kemiringan garis pada standar rafinosa sebesar 114977. Nilai tersebut sangat besar, sehingga perubahan konsentrasi rafinosa yang kecil pada sampel akan sangat mempengaruhi sinyal detektor yang dihasilkan. 18 Gambar 4. Kurva standar rafinosa Persamaan kurva standar stakiosa dapat dilihat pada gambar 5 yaitu y = 120993x + 67842 dengan koefisien korelasi r 2 sebesar 0.999. Koefisien korelasi yang dihasilkan pada standar stakiosa juga telah memenuhi persyaratan metode yang baik dari segi linieritas. Nilai kemiringan garis pada standar stakiosa yaitu sebesar 120993. Nilai kemiringan yang tinggi pada standar stakiosa menunjukkan tingkat sensitifitas yang tinggi pada pengukuran stakiosa dalam sampel, artinya perubahan konsentrasi stakiosa yang kecil akan sangat mempengaruhi sinyal detektor yang dihasilkan pada HPLC. Gambar 5. Kurva standar stakiosa 315892.0 400907.0 577217.3 749289.3 797194.5 1069260.9 y = 114977x + 70799 R² = 0.998 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Konsentrasi rafinosa mgml 338353.5 403306.7 607089.3 780268.0 869088.4 1120426.6 y = 120993x + 67842 R² = 0.999 0.0 200000.0 400000.0 600000.0 800000.0 1000000.0 1200000.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Konsentrasi stakiosa mgml Luas area nRIU.s Luas area nRIU.s 19

2. Penentuan LOD dan LOQ