13 tersebut berupa monosakarida, disakarida, dan oligosakarida. Ekstrasi dengan etanol 70 dilakukan
pada suhu 70
o
C selama 1 jam, kemudian hasil ekstrak tersebut dianalisis dengan menggunakan HPLC.
4. Analisis HPLC
Oligosakarida tepung kedelai yang telah diisolasi kemudian dianalisis dengan menggunakan HPLC. HPLC yang digunakan dilengkapi dengan peralatan sebagai berikut :
1. degasser model G1322A Agilent, pompa solvent model G1310A Agilent, dan detektor
refractive index model G1362A Agilent. 2.
Kolom ZORBAX Carbohydrate Analysis Columns berukuran 5 m × 4.6 mm × 150 mm yang dilapisi dengan 3-aminopropylsilane pada partikel silica.
3. Fase gerak yang digunakan adalah campuran dari acetonitrile dan air 75:25 dengan
kecepatan aliran 1.5 mlmenit. 4.
Standar pada pengujian oligosakarida adalah rafinosa dan stakiosa dari Sigma, serta standar gula sederhana berupa fruktosa, glukosa, dan sukrosa dari Merck.
5. Uji kualitatif dekstrin
Uji kulitatif dekstrin dilakukan untuk mengetahui secara kualitatif apakah terdapat komponen dekstrin pada sampel. Hal ini dilakukan karena diduga terdapat beberapa sampel yang menambahkan
dekstrin pada produknya namun tidak menyebutkannya dalam komposisi produk. Sampel yang mengandung dekstrin atau diduga mengandung dekstrin akan menghasilkan peak rafinosa yang besar
sehingga dibutuhkan perhitungan tertentu untuk mengetahui komponen rafinosa yang sesungguhnya.
6. Perhitungan kadar rafinosa pada sampel yang mengandung dekstrin atau
diduga mengandung dekstrin
Sampel yang mengandung dekstrin adalah sampel yang pada label kemasan mencantumkan dekstrinmaltodekstrin sebagai komposisinya, sedangkan sampel yang diduga mengandung dekstrin
adalah sampel yang pada label kemasan tidak mencantumkan dekstrinmeltodekstrin sebagai komposisinya, namun berdasarkan uji kualitatif dekstrin dan hasil pembacaan HPLC diperoleh adanya
kandungan dekstrin didalamnya. Pada sampel yang mengandung dekstrin atau diduga mengandung dekstrin, kadar rafinosa
yang diperoleh sangat besar, hal ini dikarenakan adanya kandungan dekstrin yang memiliki berat molekul yang sama dengan rafinosa sehingga menutupi peak rafinosa ketika dianalisis dengan HPLC.
Oleh karena itu diperlukan perhitungan untuk menduga kadar rafinosa yang ada pada sampel tanpa pengaruh dari komponen dekstrin.
7. Analisis data
Analisis data dilakukan menggunakan SPSS 17.0. Uji yang dilakukan adalah independent t- test Uji t untuk kandungan rafinosa dan stakiosa pada sampel. Uji t dilakukan untuk mengetahui
apakah ada perbedaan nyata antara data batch I dan II. Uji lainnya adalah one way ANOVA dan uji lanjut Duncan untuk mengetahui apakah ada perbedaan nyata antar kelompok sampel dan antar
sampel dalam satu kelompok.
14
C. Prosedur Analisis
1. Linearitas Epshtein, 2004
Menurut Epshtein 2004 penentuan linearitas dapat dilakukan dengan enam konsentrasi yang berbeda. Standar yang digunakan adalah rafinosa dan stakiosa. Penentuan konsentrasi standar
dilakukan berdasarkan keterangan pada panduan penggunaan kolom HPLC. Keterangan tersebut menunjukkan kemampuan kolom dalam membaca standar. Konsentrasi standar rafinosa yang
digunakan adalah 8.66 mgml sedangkan pada standar stakiosa sebesar 8.77 mgml. Konsentrasi tersebut kemudian dilakukan pengenceran sehingga diperoleh enam seri konsentarsi standar.
Larutan stock rafinosa dibuat dengan menimbang sebanyak 8.66 mg standar rafinosa kemudian ditepatkan dalam labu takar 10 ml dengan larutan acetoniril:air 1:1. Larutan stock stakiosa
dibuat dengan dengan menimbang sebanyak 8.77 mg standar stakiosa kemudian ditepatkan dalam labu takar 10 ml dengan larutan acetoniril:air 1:1. Larutan stock tersebut kemudian dilakukan
pengenceran dengan perbandingan 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, dan 3:1 dengan larutan acetoniril:air 1:1 untuk membuat seri pengenceran pada standar rafinosa dan stakiosa. Sebanyak 20 l larutan dari setiap seri
pengenceran standar dianalisis dengan HPLC dengan tiga kali ulangan untuk setiap konsentrasi. Linearitas ditentukan menggunakan metode regresi kuadrat linear dari kurva hubungan luas area
dengan konsentrasi standar. Persamaan linearitas yang digunakan adalah y = a + bx dengan y merupakan luas area dan x merupakan konsentrasi standar.
2. Penentuan LOD dan LOQ Epshtein, 2004
Penentuan LOD dan LOQ dilakukan dengan mengukur respon detektor terhadap konsentrasi terendah sebanyak tujuh kali ulangan, kemudian ditentukan standar deviasi dari ulangan tersebut dan
dilakukan perhitungan LOD dengan persamaan 2.1 dan LOQ dengan persamaan 2.2. LOD = 3 x standar deviasi
LOQ = 10 x standar deviasi
3. Penentuan
persen recovery Epshtein, 2004
Menurut Epshtein 2004 penentuan persen recovery dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah tertentu analit ke dalam sampel kemudian diperiksa dengan menggunakan metode analisis.
Sebanyak 15 mg standar rafinosa dan 14 mg standar stakiosa ditambahkan ke dalam 2 gram isolat protein kedelai. Sampel tersebut kemudian dilakukan ekstraksi oligosakarida dan dianalisis dengan
menggunakan HPLC. Selanjutnya persen recovery ditentukan dengan persamaan 3.1. 100
Keterangan : A = konsentrasi standar pada sampel yang ditambahkan standar mgg
B = konsentrasi standar pada sampel tanpa penambahan standar mgg C = konsentrasi standar yang ditambahkan mgg
4. Analisis kadar air metode oven AOAC Official Method. 925.10, 2005
Cawan aluminium kosong dikeringkan dalam oven suhu 105
o
C selama 15 menit lalu didinginkan dalam desikator selama 5 menit atau sampai tidak panas lagi. Cawan ditimbang dan
dicatat beratnya. Sejumlah sampel 1 gram dimasukkan ke dalam cawan kosong yang telah diketahui 2.1
2.2
3.1
