14
C. Prosedur Analisis
1. Linearitas Epshtein, 2004
Menurut Epshtein 2004 penentuan linearitas dapat dilakukan dengan enam konsentrasi yang berbeda. Standar yang digunakan adalah rafinosa dan stakiosa. Penentuan konsentrasi standar
dilakukan berdasarkan keterangan pada panduan penggunaan kolom HPLC. Keterangan tersebut menunjukkan kemampuan kolom dalam membaca standar. Konsentrasi standar rafinosa yang
digunakan adalah 8.66 mgml sedangkan pada standar stakiosa sebesar 8.77 mgml. Konsentrasi tersebut kemudian dilakukan pengenceran sehingga diperoleh enam seri konsentarsi standar.
Larutan stock rafinosa dibuat dengan menimbang sebanyak 8.66 mg standar rafinosa kemudian ditepatkan dalam labu takar 10 ml dengan larutan acetoniril:air 1:1. Larutan stock stakiosa
dibuat dengan dengan menimbang sebanyak 8.77 mg standar stakiosa kemudian ditepatkan dalam labu takar 10 ml dengan larutan acetoniril:air 1:1. Larutan stock tersebut kemudian dilakukan
pengenceran dengan perbandingan 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, dan 3:1 dengan larutan acetoniril:air 1:1 untuk membuat seri pengenceran pada standar rafinosa dan stakiosa. Sebanyak 20 l larutan dari setiap seri
pengenceran standar dianalisis dengan HPLC dengan tiga kali ulangan untuk setiap konsentrasi. Linearitas ditentukan menggunakan metode regresi kuadrat linear dari kurva hubungan luas area
dengan konsentrasi standar. Persamaan linearitas yang digunakan adalah y = a + bx dengan y merupakan luas area dan x merupakan konsentrasi standar.
2. Penentuan LOD dan LOQ Epshtein, 2004
Penentuan LOD dan LOQ dilakukan dengan mengukur respon detektor terhadap konsentrasi terendah sebanyak tujuh kali ulangan, kemudian ditentukan standar deviasi dari ulangan tersebut dan
dilakukan perhitungan LOD dengan persamaan 2.1 dan LOQ dengan persamaan 2.2. LOD = 3 x standar deviasi
LOQ = 10 x standar deviasi
3. Penentuan
persen recovery Epshtein, 2004
Menurut Epshtein 2004 penentuan persen recovery dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah tertentu analit ke dalam sampel kemudian diperiksa dengan menggunakan metode analisis.
Sebanyak 15 mg standar rafinosa dan 14 mg standar stakiosa ditambahkan ke dalam 2 gram isolat protein kedelai. Sampel tersebut kemudian dilakukan ekstraksi oligosakarida dan dianalisis dengan
menggunakan HPLC. Selanjutnya persen recovery ditentukan dengan persamaan 3.1. 100
Keterangan : A = konsentrasi standar pada sampel yang ditambahkan standar mgg
B = konsentrasi standar pada sampel tanpa penambahan standar mgg C = konsentrasi standar yang ditambahkan mgg
4. Analisis kadar air metode oven AOAC Official Method. 925.10, 2005
Cawan aluminium kosong dikeringkan dalam oven suhu 105
o
C selama 15 menit lalu didinginkan dalam desikator selama 5 menit atau sampai tidak panas lagi. Cawan ditimbang dan
dicatat beratnya. Sejumlah sampel 1 gram dimasukkan ke dalam cawan kosong yang telah diketahui 2.1
2.2
3.1
15 beratnya. Cawan beserta isi dikeringkan di dalam oven bersuhu 105
C. Pengeringan dilakukan sampai diperoleh bobot konstan. Setelah dikeringkan, cawan dan isinya didinginkan di dalam desikator,
ditimbang berat akhirnya, dan dihitung kadar airnya dengan persamaan 4.1. 100
Keterangan : x = berat cawan dan sampel sebelum dikeringkan g
y = berat cawan dan sampel setelah dikeringkan g a = berat cawan kosong g
5. Ekstraksi oligosakarida Wang
et al., 2007
Sebanyak 2 gram tepung kedelai dihilangkan lemaknya dengan penambahan heksana, kemudian saring dengan kertas Whatman41. Residu secara kuantitatif dipindahkan ke dalam gelas
piala. Oligosakarida diekstrak dengan menambahkan 20 ml etanol 70 , kemudian dipanaskan pada suhu 70
o
C selama 1 jam dalam waterbath shaker. Setelah itu dilakukan sentrifuse selama 30 menit pada 2400 rpm. Supernatan hasil sentrifuse diambil sebanyak 5 ml dan dihembuskan dengan N
2
untuk menghilangkan etanol. Kemudian ditambahkan 0.5 ml larutan acetonitrile-air 1:1 dan disaring
dengan membrane filter 0,45 µ m sebelum diinjeksi pada HPLC. Proses ekstraksi oligosakarida pada sampel dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Diagram alir ekstraksi oligosakarida kedelai 2 g tepung kedelai + 20 ml heksana
Pengadukan dengan magnetic stirrer selama 3 jam
Penambahkan 20 ml etanol 70, panaskan pada suhu 70
o
C selama 1 jam Penyaringan dengan kertas Whatman41
Pemindahan residu secara kuantitatif ke dalam gelas piala
Penyaringan dengan membrane filter nylon 0,45 µ m sebelum diinjek pada HPLC Penambahan 0.5 ml acetonitrile:air 1:1
Penghilangan etanol dengan dihembus gas N
2
Pemindahan 5 ml supernatan ke dalam vial tertutup Sentrifuse 30 menit pada 2400 rpm
4.1
16
6. Uji kualitatif dekstrin SNI 01-2593–1992
Kategori