Persiapan sampel Ekstraksi oligosakarida

11

III. METODE PENELITIAN

A. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah kedelai, isolat protein kedelai, kedelai yang ditambahkan dekstrin, serta dua puluh produk minuman bubuk komersial berbasis kedelai, sedangkan bahan kimia yang digunakan untuk analisa oligosakarida adalah standar rafinosa Sigma, standar stakiosa Sigma, standar glukosa Merck, standar sukrosa Merck, standar fruktosa Merck, heksana Merck, etanol Merck, air HPLC grade Merck, acetonitril Merck, gas N 2 , iodin, KI, dan aquades. Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah HPLC Agylent yang dilengkapi dengan degasser model G1322A Agilent, pompa solvent model G1310A Agilent, dan detektor refractive index model G1362A Agilent, kolom HPLC untuk karbohidrat ZORBAX Carbohydrate Analysis Columns berukuran 5 m × 4.6 mm × 150 mm Agilent, vacuum rotary evaporator, magnetic stirrer, kertas Whatman41, membrane filter 0,45-µ m nylon, erlenmeyer, buret, gelas piala, neraca analitik, pipet tetes, penjepit cawan gegep, cawan porselen, tabung reaksi, penangas air, gelas ukur, labu takar 10 ml, labu takar 50 ml, labu takar 100 ml, desikator, dan oven tanur.

B. Metode Penelitian

Penelitian ini terdiri dari empat tahapan. Tahap pertama adalah persiapan sampel. Tahap kedua adalah melakukan validasi metode HPLC yang meliputi linieritas, penentuan limit of detection LOD, penentuan limit of quantification LOQ, dan penentuan persen recovery. Tahap ketiga adalah analisis kadar oligosakarida pada dua puluh minuman bubuk komersial berbasis kedelai dengan menggunakan metode HPLC dan tahap terakhir adalah analisis data.

1. Persiapan sampel

Tahap awal dari persiapan sampel adalah mendata sebanyak-banyaknya minuman bubuk berbasis kedelai yang dijual di Indonesia. Tahap selanjutnya adalah mensurvei keberadaan produk- produk tersebut di pasaran. Survei dilakukan di Bogor, Semarang, dan Jakarta. Tahap selanjutnya adalah memilih sampel untuk penelitian hingga akhirnya terpilih dua puluh sampel. Sampel-sampel terpilih tersebut kemudian digolongkan berdasarkan usia konsumen, yaitu sampel yang ditujukan untuk konsumen diatas 3 tahun, untuk konsumen 1-3 tahun, dan untuk konsumen 0-1 tahun. Kedua puluh sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel minuman bubuk produksi PT Nutricia Indonesia Sejahtera Indonesia, PT Nutrifood Indonesia Indonesia, Abbott Laboratories B.V Netherlands, Wyeth Nutritionals Ireland Ireland, NBTY Manufacturing LLC USA, PT Gizindo Mitra Sukses Indonesia, Glisindo Indonesia, CV Intan Alami Indonesia, Dodo- Mis Indonesia, IND Herbal Indonesia, Soya Jaya Sentosa Indonesia, Melilea China, dan PT Amco Mandiri Pratama Indonesia. Penggolongan sampel dilakukan dengan melihat target konsumen dari produk-produk tersebut, yaitu konsumen berusia diatas 3 tahun, 1-3 tahun, dan 0-1 tahun. Sampel yang ditujukan untuk usia 3 tahun ke atas dibagi lagi menjadi sampel minuman untuk konsumen golongan khusus dan konsumen biasa. Penggolongan menjadi konsumen golongan khusus dan konsumen biasa didasarkan pada komposisi bahan dan pernyataan pada label yang menyatakan bahwa produk ditujukan untuk konsumen golongan khusus. 12

2. Validasi metode HPLC

a. Linearitas

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung serta proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linieritas dinyatakan sebagai koefisien korelasi dari kurva standar Harmita, 2004. Menurut Epshtein 2004 pembuatan kurva standar dilakukan dengan membuat stock standar dengan konsentrasi tertentu. Kemudian dilakukan pengenceran untuk konsentrasi standar berikutnya, sehingga diperoleh deret standar dengan konsentrasi yang berbeda. Selanjutnya deret standar tersebut dianalisis sehingga didapat kurva hubungan konsentrasi dan respon detektor. Linieritas dinyatakan sebagai koefisien korelasi dari kurva standar. Menurut Papadoyanis dan Samanidou 2005, linieritas pada HPLC dapat ditentukan dengan melakukan tiga sampai enam kali injeksi pada lima atau lebih seri konsentrasi standar yang digunakan. Konsentrasi yang digunakan dapat berkisar antara 80-120 dari konsentrasi yang diharapkan, atau 50-150, bahkan dapat dilakukan dengan 25-125.

b. Penentuan

limit of detection LOD dan limit of quantification LOQ Limit of detection LOD atau batas deteksi merupakan konsentrasi terendah dari suatu analit yang masih dapat dideteksi, sedangkan limit of quantification LOQ atau batas kuantitas adalah konsentrasi terendah dari suatu analit yang dapat diukur secara tepat dan teliti Jenke, 2005. Menurut Epshtein 2004 LOD merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan, sedangkan LOQ merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. LOD dan LOQ dapat diukur berdasarkan nilai standar deviasi dari konsentrasi terendah.

c. Penentuan

persen recovery Penentuan persen recovery bertujuan untuk mengetahui berapa banyak komponen yang dianalisis dapat hilang akibat proses preparasi, sehingga dapat menyatakan keakuratan metode yang digunakan. Semakin besar persen recovery, artinya semakin sedikit komponen yang hilang akibat preparasi yang dilakukan sehingga hasil yang diperoleh lebih akurat. Menurut Epshtein 2004 penentuan persen recovery dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah tertentu analit ke dalam sampel kemudian diperiksa dengan menggunakan metode analisis. Hasil tersebut kemudian dibandingkan dengan hasil analisis tanpa penambahan analit. Persen recovery dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya.

3. Ekstraksi oligosakarida

Analisis oligosakarida dilakukan pada 20 produk minuman bubuk komersial berbasis kedelai. Selain itu dilakukan juga simulasi analisis oligosakarida pada bahan utama yang biasa digunakan pada produk-produk komersial, yaitu bubuk kedelai, isolat protein kedelai, serta bubuk kedelai yang ditambahkan dekstrin komersial. Pengujian pada 20 produk komersial dilakukan pada dua batch produksi yang berbeda dengan dua kali ulangan. Hasil analisis tersebut kemudian dibandingkan dan dianalisis dengan menggunakan uji independent t-test pada program SPSS untuk mengetahui hasilnya berbeda nyata atau tidak. Ekstraksi oligosakarida dilakukan dengan menggunakan metode Wang et al. 2007, yaitu dengan mengekstrak komponen gula sederhana pada sampel dengan larutan etanol 70, yang sebelumnya dilakukan penghilangan lemak dengan menggunakan heksana. Komponen gula sederhana 13 tersebut berupa monosakarida, disakarida, dan oligosakarida. Ekstrasi dengan etanol 70 dilakukan pada suhu 70 o C selama 1 jam, kemudian hasil ekstrak tersebut dianalisis dengan menggunakan HPLC.

4. Analisis HPLC