29 Sampel pangan nasi goreng
Pengenceran 10
-1
Sampel pangan tanpa inokulasi
Isolasi DNA Pengenceran 10
-1
-10
-6
Inokulasi artifisial KM 10
-2
Metode pendidihan Metode ekstraksi dengan fenol:kloroform
Amplifikasi Real-time PCR Gambar 7. Tahapan kerja pada uji amplifikasi DNA B. cereus dalam nasi goreng
C. BAHAN DAN ALAT
1. Identifikasi Serovar Salmonella spp.
a. Kultur bakteri
Galur bakteri yang digunakan dalam uji serologi ialah Salmonella
spp. yang diisolasi dari daging ayam yang berasal dari pasar lokal. Sepuluh isolat yang disimpan dalam Brain Heart
Infusion Broth BHIB merupakan koleksi Departemen Ilmu dan
Teknologi Pangan, Institut Pertanian Bogor dan telah ditetapkan sebagai Salmonella spp. berdasarkan uji biokimia.
b. Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah Nutrien Agar Merck dan Antisera O National Salmonella Centre – Statens Seruminstitut.
c. Alat-alat
Alat-alat yang digunakan adalah gelas objek slide, cawan petri, pipet mikro, jarum ose, dan Laminar Air Flow Vision.
30
2. Metode Deteksi B. cereus Berbasiskan DNA
a. Kultur bakteri
Galur referensi yang digunakan merupakan jenis bakteri Gram positif, Bacillus cereus ATCC 11778 dan Bacillus subtilis ATCC
6633 NCTC 10400. Bakteri-bakteri tersebut ditumbuhkan di Trypticase Soy Broth
TSB Merck pada suhu 37°C. Sel bakteri dihitung dengan perhitungan cawan sebar USFDA, 2001
pada media agar spesifik Mannitol Yolk Polymixin Agar MYPA Oxoid
dan diinkubasi pada suhu 30°C selama 48-72 jam. Sampel pangan yang dianalisa adalah pangan yang banyak mengandung karbohidrat
yaitu nasi goreng. Sampel diambil dari tempat penjualan makanan di sekitar kampus IPB, Bogor.
b. Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah Ilustra Bacteria Genomic Prep Mini Spin Kit
GE Healthcare yang terdiri dari: buffer lisis, buffer elusi, dan buffer pencuci. Selain itu juga digunakan Lisozim
USB, Proteinase K USB, RNAse A USB, CTAB Merck, PBS Merck, EDTA Merck, Tris-HCl solution USB, Triton-X
solution USB, SDS solution USB, Isopropanol Merck,
Amonium asetat Merck, Fenol Merck, Kloroform Merck, Asam asetat glasial Merck, NaCl Merck, Etanol absolut Merck,
MiliQ, RNAse free water USB, IQ SYBR Green Bio-Rad, Primer forward
dan reverse BceT Bio-Rad, isolat DNA yang diekstrak dari kultur murni B. cereus pengenceran 10
-1
-10
-8
, isolat DNA dari sampel pangan yang tidak diinokulasi pengenceran 10
-1
, isolat DNA yang telah diinokulasi secara artifisial pengenceran 10
-1
-10
-6
.
c. Alat-alat
Alat-alat yang digunakan adalah Stomacher Seward, Refrigerator Microsentrifuge Hettich, Water Bath, Laminar Air
Flow Vision, Hot Plate Thermolyne, Touch Mixer Thermolyne,
31 Analytical Balance
Shimadzu, Autoklaf Hirayama, Automatic Colony Counter
Acolyte, Lampu UV, kamera digital, tabung mikrosentrifus 1.5 ml, tabung konikal 15 ml Iwaki, inkubator,
bunsen, pipet mikro Eppendorf, pipet volumemetrik, bulb, gelas piala, gelas ukur, labu Erlenmeyer, botol semprot, cawan petri, jarum
ose, tabung reaksi, rak tabung reaksi, sudip, magnetic stirrer, gelas pengaduk, Real-time PCR Bio-Rad, micro well, dan adhesive
sealer .
D. METODE PENELITIAN
1. Identifikasi Serovar Salmonella spp. WHO, 2009
