34 diambil 1 ml untuk diisolasi DNA-nya dan diambil 0.1 ml untuk
diiinokulasikan pada MYPA dan dihitung koloni B. cereus yang tumbuh. Pengamatan dan penghitungan koloni dilakukan setelah
MYPA diinkubasi 37ºC selama 2 hari. Perhitungan koloni tipikal B. cereus mengikuti hitungan cawan USFDA, 2001.
Koloni tipikal B. cereus pada MYPA adalah koloni pink cerah dan dikelilingi zona presipitasi. Cawan yang digunakan
untuk perhitungan ialah cawan dengan koloni tipikal berkisar antara 15-150 koloni. Perhitungan jumlah koloni per ml
dilakukan dengan Standard Plate Count BAM edisi ke-8 dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan: N = jumlah koloni per ml atau per g produk ∑C = jumlah semua koloni yang dihitung
n1 = jumlah cawan pada pengenceran pertama n2 = jumlah cawan pada pengenceran kedua
d = pengenceran pertama yang dihitung
b. Tahap isolasi DNA
Sebanyak 1 ml dari masing-masing pengenceran diisolasi DNA- nya dengan tiga metode, yaitu 1 Metode pendidihan, 2 Metode
ekstraksi dengan fenol:kloroform, dan 3 Metode ekstraksi dengan kit komersial. Metode pendidihan dan metode ekstraksi dengan
fenol:kloroform digunakan untuk perbandingan hasil amplifikasi dengan kit komersial dalam uji sensitivitas dan spesifisitas. Berikut
ini uraian prosedur kerja dalam ketiga metode tersebut.
1 Metode pendidihan Hein et al., 2001 dengan modifikasi
Kultur murni atau sampel pangan yang telah dihomogenisasi dan dilakukan pengenceran 10
-1
-10
-8
diambil masing-masing 1 ml, lalu disentrifus. Supernatan dibuang dan
pelet dicuci dengan 500 µl buffer TE 1X sebanyak dua kali, disentrifus, kemudian pelet disuspensikan dengan buffer TE 1X
35 dan lisozim, diinkubasi pada suhu ruang 25°C selama
15 menit, ditambahkan proteinase K, setelah itu diinkubasi pada suhu 55°C selama 1 jam, kemudian dididihkan selama 15 menit,
didinginkan dalam freezer 4°C selama 30 menit, dan supernatan digunakan sebagai sumber DNA target. Prosedur
kerjanya dapat dilihat pada Lampiran 6. Modifikasi yang dilakukan terhadap metode pendidihan
Hein et al., 2001 adalah waktu sentrifugasi dari 5700 g selama 15 menit menjadi 14000 g selama 10 menit untuk menjamin
seluruh bakteri telah menjadi pelet, kemudian setelah pendidihan 100°C selama 15 menit, suspensi DNA tidak
disentrifus, melainkan segera didinginkan dalam freezer 4°C selama 30 menit untuk merenaturasi DNA yang telah
terdenaturasi saat dididihkan.
2 Metode ekstraksi dengan fenol:kloroform Sambrook et al.,
1989 dengan modifikasi
Kultur murni atau sampel pangan yang telah dihomogenisasi dan dilakukan pengenceran 10
-1
-10
-8
diambil masing-masing 1 ml, lalu disentrifus dan pelet diresuspensi
dengan 500 µl buffer TE 1X sebanyak 2 kali. Setelah disentrifus, pelet diresuspensi dengan 500 µl buffer TE 1X dan
100 µl lisozim, diinkubasi pada suhu 4°C selama 5 menit. Kemudian ditambahkan 25 µl SDS 10, 50 µl NaCl 5M, dan
100 µl proteinase K 20 mgml, divortex dan diinkubasi pada suhu 55°C selama 2 jam. Selanjutnya ditambahkan 500 µl
fenol:kloroform 1:1 vv, divortex dan diinkubasi -20°C selama 30 menit, lalu disentrifus pada suhu 4°C, 12000 rpm selama
10 menit. Lapisan air bagian atas diambil dan dipindahkan ke tabung eppendorf baru, ditambahkan 500 µl fenol:kloroform
1:1 vv, divortex dan diinkubasi -20°C selama 30 menit, lalu disentrifus pada suhu 4°C, 12000 rpm selama 10 menit. Lapisan
36 air bagian atas diambil dan dipindahkan ke tabung eppendorf
baru, ditambahkan 500 µl kloroform, disentrifus pada suhu 4°C, 12000 rpm selama 10 menit. Lalu lapisan air bagian atas
dipindahkan ke tabung eppendorf baru, ditambahkan 0.3 kali volume lapisan air ammonium asetat 10M pH 7.4 dan
isopropanol dingin 1 kali volume fase aqueous, diinkubasikan -20°C selama semalam, kemudian disentrifus 14000 rpm selama
30 menit. Selanjutnya pelet ditambah dengan 500 µl etanol 70 dan disentrifus 12000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang
dan pelet dikeringudarakan, kemudian dilarutkan dalam 50 µl buffer TE 1X. Prosedur kerja metode ekstraksi dengan
fenol:kloroform ini dapat dilihat pada Lampiran 7. Modifikasi yang dilakukan terhadap metode pendidihan
Hein et al., 2001 adalah buffer lisis yang digunakan pada metode Sambrook et al. 1989 pada 1 ml kultur bakteri diganti
dengan buffer TE untuk menjaga tekanan osmosis bakteri, campuran buffer lisis pada Sambrook et al. 1989 yaitu
100 mM NaCl, 500 mM Tris pH 8.0, 10 sodium dodecylsulphate, dan 0.2 mgml proteinase K diganti dengan
campuran buffer yang diberikan bertahap, terdiri atas 500 µl buffer TE 1X dan 100 µl lisozim untuk merusak dinding sel
bakteri, kemudian ke dalam campuran buffer dan kultur bakteri ditambahkan 25 µl SDS 10, 50 µl NaCl 5M, dan 100 µl
proteinase K 20 mgml untuk menhilangkan protein yang dapat mengganggu amplifikasi. Modifikasi juga dilakukan pada
komposisi pelarut fenol:kloroform 1:1 vv sebagai ganti dari pelarut fenol:kloroform:isoamil alkohol 25:24:1 vvv.
Kloroform biasanya ditambahkan dengan isoamil alkohol dengan perbandingan 24:1 untuk mengurangi busa yang
terbentuk ketika ekstraksi. Campuran senyawa ini sering disebut CIAA Chloroform Isoamyl Alcohol. Pelarut ini dimodifikasi
karena keterbatasan pelarut isoamil alkohol. Fase aqueous dari
37 ekstraksi dengan fenol:kloroform pada metode Sambrook et al.
1989 ditambahkan 0.3 M Natrium Asetat pH 4.8, namun pada metode yang dimodifikasi garam yang ditambahkan adalah
10 M Ammonium Asetat pH 7.4 disesuaikan dengan garam yang tersedia. Kedua garam tersebut berfungsi sama dan dapat
saling menggantikan. Selain itu, etanol absolut pada metode Sambrook et al. 1989 diganti dengan isopropanol karena
isopropanol lebih cepat mempresipitasikan DNA, lalu waktu dan kecepatan sentrifus diganti dari 15 menit menjadi 30 menit
untuk memperoleh pelet DNA karena waktu 15 menit tidak cukup untuk mengendapkan DNA di dasar tabung. Pelet yang
dikeringvakumkan diganti dengan cara dikeringudarakan karena keterbatasan instrumen.
3 Metode ekstraksi sesuai panduan kit komersial
Sebanyak 1 ml kultur murni B. cereus dari delapan tingkat pengenceran masing-masing dimasukkan ke dalam tabung
mikrosentrifus dan disentrifus dengan kecepatan 14000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang terdapat dalam tabung dibuang
tanpa merusak pelet, lalu ditambahkan 40 µL buffer lisozim dan segera divorteks selama 10 detik sampai sel bakteri benar-benar
tersuspensi, kemudian suspensi tersebut ditambahkan 20 µL lisozim, divorteks dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu
kamar 25ºC, lalu disentrifus 5000 rpm selama 5 detik untuk mengumpulkan sampel di dasar tabung. Inkubasi dilanjutkan
pada suhu kamar 25ºC selama 5 menit. Kemudian 20 µL Proteinase K ditambahkan ke dalam sampel, lalu divorteks.
Setelah itu, ditambahkan 10 µL buffer lisis, divorteks dan disentrifus 5000 rpm selama 5 detik. Suspensi diinkubasi pada
suhu 55
o
C selama 7 menit, divorteks selama 10 detik dan disentrifus 5000 rpm selama 5 detik. Proses inkubasi dilanjutkan
pada suhu 55
o
C selama 8 menit, kemudian disentrifus 5000 rpm
38 selama 5 detik. Lalu ditambahkan 5 µL RNAse-A, divorteks
dan disentrifus 5000 rpm selama 5 detik. Sampel kembali diinkubasi pada suhu kamar 25ºC selama 15 menit. Setelah itu,
ditambahkan 500 µl buffer lisis, divorteks selama 10 detik dan inkubasi pada suhu kamar 25ºC selama 5 menit. Setelah itu,
cairan dipindahkan ke dalam kolom mini yang diletakkan di dalam collection tube dan disentrifus pada 15000 rpm selama
1 menit, lalu cairan pada collection tube dibuang dan kolom diletakkan pada collection tube.
Sebanyak 500 µL buffer lisis ditambahkan ke dalam kolom mini dan disentrifus 15000 rpm selama 1 menit, kemudian
cairan pada collection tube dibuang kembali dan kolom diletakkan kembali ke dalam collection tube. Setelah itu, ke
dalam kolom mini ditambahkan 500 µL wash buffer dan disentrifus dengan kecepatan 14000 rpm selama 3 menit,
kemudian collection tube dan kolom mini dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus baru. Sebanyak 200 µL buffer elusi
70
o
C ditambahkan ke dalam matriks fiber dalam kolom mini, lalu diinkubasi pada suhu kamar 25ºC selama 1 menit dan
disentrifus pada 14000 rpm selama 1 menit. Cairan pada tabung mikrosentrifus digunakan sebagai isolat DNA. Prosedur kerja
metode isolasi DNA dengan kit komersial dapat dilihat pada Lampiran 8.
c. Tahap amplifikasi Alarcon et al., 2006 dengan modifikasi
