23
2. Pembacaan Produk Hasil Real-Time PCR
Amplifikasi yang dijalankan dalam thermal cycler ditampilkan dalam bentuk grafik pada layar komputer dengan software yang aplikabel
terhadap thermal cycler, contohnya adalah software IQ-5 Bio-Rad. Grafik-grafik yang diperoleh berupa grafik amplifikasi, kurva standar, dan
kurva peleburan melt curve. Grafik tersebut digunakan untuk mengevaluasi kinerja amplifikasi real-time PCR.
a. Grafik amplifikasi
Grafik amplifikasi terbentuk semenjak proses amplifikasi dimulai. Grafik ini berfungsi untuk menentukan apakah dalam
thermal cycler terjadi amplifikasi atau tidak. Grafik amplifikasi
dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini.
Gambar 2. Grafik sigmoidal proses amplifikasi dengan real-time
PCR Edwards et al., 2004 Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas fluoresen,
semakin banyak produk amplifikasi yang dihasilkan, semakin besar akumulasi fluoresen yang terbaca. Peningkatan fluoresen tersebut
ditandai dengan terbentuknya gradik sigmoidal, seperti yang tergambar pada Gambar 2 garis hijau. Grafik sigmoid akan
berpotongan dengan base line threshold yang telah ditentukan secara otomatis oleh program. Titik perpotongan antara grafik sigmoid dan
base line threshold jika direfleksikan terhadap sumbu x Cycle
adalah threshold cycle Ct bagi sampel yang diamplifikasi. Garis
PCR Base Line Subtrac
ted RFU
Base line threshold DNA tidak
teramplifikasi DNA
teramplifikasi
Perpotongan siklus dan Bt
Ct Cycle
24 biru pada Gambar 2 akan terbentuk jika tidak terjadi amplifikasi
pada thermal cycler. Nilai Ct adalah siklus di atas noise dimana akumulasi produk
senilai 2
n
, n ialah jumlah pengulangan siklus amplifikasi terbaca pertama kali pada fase eksponensial. Fase eksponensial berakhir
menjadi fase plato saat pereaksi dalam campuran reaksi PCR sudah habis. Nilai Ct digunakan dalam kurva standar sebagai fungsi
terhadap log konsentrasi bakteri.
b. Kurva standar
Kultur murni bakteri yang telah diketahui konsentrasinya CFUml diencerkan hingga diperoleh konsentrasi bakteri terendah
1 CFUml. Seluruh tingkat pengenceran yang berturut-turut, misalnya mengandung 10
-10
6
CFUml diisolasi DNAnya dan diamplifikasi. Amplifikasi beberapa tingkat pengenceran suatu kultur
murni secara otomatis oleh software IQ-5 akan digambarkan dalam bentuk kurva standar, selain grafik amplifikasi. Kurva standar
amplifikasi disajikan dalam Gambar 3.
Gambar 3. Kurva standar amplifikasi kultur murni dari enam tingkat pengenceran dengan real-time PCR Edwards
et al ., 2004
Enam titik pada kurva standar menunjukkan terdapat enam tingkat pengenceran yang masing-masing memiliki nilai Ct. Kurva
Log konsentrasi bakteri CFUml Thres
hold c y
cle Ct
Kurva Standar
25 standar merupakan hubungan antara log konsentrasi bakteri dan
threshold cycle Ct. Kurva ini digunakan dalam penetapan limit
deteksi konsentrasi bakteri yang belum diketahui pada suatu sampel pangan. Penetapan limit deteksi tersebut memanfaatkan persamaan
linear yang dibentuk kurva standar. Nilai Ct yang diketahui setelah isolat DNA diamplifikasi merupakan nilai y dan log konsentrasi
merupakan nilai x dalam persamaan linear tersebut sehingga konsentrasi bakteri dalam suatu sampel pangan dapat diketahui.
c. Melt curve
Kurva peleburan atau melt curve merupakan kurva hubungan antara suhu T dan turunan dari unit fluoresen -dRFUdT
digunakan untuk memonitor perubahan dalam suhu peleburan, yaitu suhu di mana 50 amplikon DNA untai ganda terpisah menjadi dua
untai tunggal. Melt curve diperoleh berdasarkan siklus yang ditambahkan setelah siklus amplifikasi. Target amplifikasi dalam
siklus tersebut adalah produk amplifikasi amplikon. Melt curve disajikan pada Gambar 4.
Gambar 4. Melt curve yang memiliki sebuah puncak Tm Puncak kurva pada melt curve merupakan nilai Tm amplikon,
jika nilainya dibaca pada sumbu absis. Amplikon yang berasal dari DNA target yang sama akan memiliki nilai Tm yang sama,
-d R
FU d
T
Suhu °C
26 ditunjukkan dengan puncak pada titik suhu yang sama. Melt curve
pada Gambar 4 memiliki nilai Tm yang sama, berarti produk berasal dari DNA yang sama yaitu DNA target dan produknya spesifik.
Selain itu melt curve mampu menunjukkan ada atau tidaknya produk non spesifik. Produk non spesifik akan membentuk puncak pada
suhu yang berbeda dengan amplikon produk spesifik atau melt curve
dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu.
27 Isolat Salmonella spp.
Pre-enrichment dalam Trypticase Soy Broth
24 jam Ditumbuhkan dalam Nutrient Agar
24 jam
Uji Serologi Antigen O Uji Motilitas dengan agar semi solid
III. METODOLOGI PENELITIAN
A. TEMPAT DAN WAKTU MAGANG
Kegiatan magang dilakukan di laboratorium Mikrobiologi Pusat Riset Obat dan Makanan, Badan POM RI, Jakarta. Waktu penelitian dilaksanakan
dari bulan Februari sampai dengan Juli 2009.
B. LINGKUP KEGIATAN PENELITIAN
Kegiatan yang dilakukan mencakup dua kegiatan, yaitu 1 melakukan identifikasi serovar Salmonella
spp. berbasiskan
imunologi dan
2 melakukan deteksi B. cereus dengan metode berbasiskan DNA. Identifikasi serovar dengan cara uji aglutinasi pada gelas objek dilakukan
terhadap sepuluh isolat Salmonella spp. yang merupakan koleksi Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB dan telah diuji secara biokimiawi. Sepuluh
isolat tersebut diuji serologi untuk mengetahui antigen O yang dimiliki oleh masing-masing isolat sebab antigen O merupakan dasar pengelompokan
serogrup Salmonella spp. Selain itu, dilakukan uji motilitas untuk mengetahui masing-masing isolat bersifat motil atau tidak. Antigen O merupakan antigen
yang diuji pertama kali pada uji serologi, sedangkan motilitas diuji sebagai prasyarat uji antigen H. Diagram alir kegiatan deteksi Salmonella spp. dapat
dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Tahapan kerja pada identifikasi serovar Salmonella spp.
28 Pengenceran 10
-1
-10
-8
Kultur murni KM B. cereus Ditumbuhkan dalam MYPA
Amplifikasi Real-time PCR Isolasi DNA
Metode pendidihan Metode ekstraksi dengan fenol:kloroform
Metode ekstraksi dengan kit komersial Kegiatan yang dilakukan untuk mendeteksi DNA B. cereus dengan real-
time PCR meliputi isolasi DNA kultur murni bakteri B. cereus dan isolasi
DNA dari sampel pangan nasi goreng, amplifikasi dan evaluasi kinerja real- time
PCR berupa limit deteksi amplikon. Isolasi DNA dilakukan dengan tiga metode, yaitu metode pendidihan, metode ekstraksi dengan fenol:kloroform,
dan metode ekstraksi dengan kit komersial. Isolat DNA B. cereus, dari kultur murni dan nasi goreng, diamplifikasi dengan real-time PCR.
Amplifikasi DNA kultur murni B. cereus digunakan untuk membentuk kurva standar, sedangkan amplifikasi DNA B. cereus dalam sampel pangan
untuk menetapkan limit deteksi B. cereus dalam nasi goreng. Tahapan kerja isolasi DNA dari kultur murni B. cereus dan dari sampel pangan disajikan
pada Gambar 6 dan 7.
Gambar 6. Tahapan kerja pada uji amplifikasi DNA kultur murni B. cereus
29 Sampel pangan nasi goreng
Pengenceran 10
-1
Sampel pangan tanpa inokulasi
Isolasi DNA Pengenceran 10
-1
-10
-6
Inokulasi artifisial KM 10
-2
Metode pendidihan Metode ekstraksi dengan fenol:kloroform
Amplifikasi Real-time PCR Gambar 7. Tahapan kerja pada uji amplifikasi DNA B. cereus dalam nasi goreng
C. BAHAN DAN ALAT
1. Identifikasi Serovar Salmonella spp.
Kategori