32
2. Metode Deteksi
B. cereus Berbasiskan DNA Alarcon et al., 2006; Fricker et al., 2007
a. Tahap persiapan
1 Persiapan media
Media yang perlu dipersiapkan untuk penyegaran kultur bakteri adalah media Trypticase Soy Broth. Media selektif untuk
isolasi bakteri adalah Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar media selektif B.cereus, Egg Yolk Emulsion serta Polymyxin B
untuk menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif. Media selektif digunakan untuk isolasi dan penghitungan kultur bakteri
patogen, baik kultur murni maupun kultur dari sampel pangan. Prosedur pembuatan media dapat dilihat pada Lampiran 2 dan 3.
2 Persiapan kultur bakteri
Bacillus cereus disegarkan pada media TSB setiap
2 minggu sekali dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam, lalu disimpan pada suhu 16°C. Untuk pengecekan kemurnian
kultur, kultur B. cereus dalam TSB diinokulasi sebanyak 1 lup ke permukaan agar Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar MYPA
padat dalam cawan petri steril. Koloni tipikal B. cereus pada MYPA dengan suplementasi polymyxin B akan berwarna pink
cerah dan dikelilingi zona presipitasi. Selain bakteri patogen B. cereus, disiapkan juga B. subtilis
yang digunakan untuk menguji spesifisitas primer BceT. Primer BceT
merupakan DNA dari gen penyandi enterotoksin T pada DNA kromosomal B. cereus. Isolat DNA bakteri tersebut
diamplifikasi kemudian melt curve yang terbentuk dianalisis untuk mengetahui apakah primer BceT dapat menempel pada
DNA kromosomal selain DNA gen penyandi enterotoksin B. cereus
yang berarti primer kurang spesifik. Bakteri ini pun disegarkan setiap 2 minggu sekali dalam TSB dan diinkubasi
33 pada suhu 37ºC selama 24 jam, lalu disimpan pada suhu 16°C.
Prosedur persiapan kultur bakteri dapat dilihat pada Lampiran 4. B. cereus
dan B.subtilis disegarkan dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam sehari sebelum DNA diisolasi. Kultur
murni B. cereus yang hendak diisolasi diencerkan terlebih dahulu 10
-1
-10
-8
, sedangkan kultur murni B. subtilis diambil 1 ml dan langsung diisolasi. Pengenceran serial kultur murni
B. cereus dilakukan untuk diisolasi DNA-nya sebanyak 1 ml
dari masing-masing pengenceran dan untuk ditumbuhkan dalam MYPA sebanyak 0.1 ml. Penumbuhan kultur bakteri dalam
MYPA dilakukan dengan teknik surface plate untuk perhitungan konsentrasi bakteri yang terdapat pada kultur murni CFUml.
Jumlah koloni pada beberapa tingkat pengenceran dan konsentrasi bakteri kultur murni B. cereus dapat dilihat pada
Lampiran 5. Konsentrasi tersebut digunakan sebagai perhitungan log konsentrasi bakteri dalam kurva standar
amplifikasi.
3 Persiapan sampel pangan
Sampel pangan yaitu nasi goreng dibagi menjadi dua, masing-masing sejumlah 25 gram dan salah satunya diinokulasi
B. cereus dengan konsentrasi 8.8 x 10
5
CFUg konsentrasi diperoleh dari perhitungan koloni dalam MYPA. Bagian
sampel pangan yang tidak diinokulasi disebut sampel pangan SP, sedangkan bagian yang diinokulasi secara artifisial dengan
kultur murni B. cereus disebut sampel pangan spike SPS. Baik SP 25 gram maupun SPS 25 gram dimasukkan ke dalam
plastik steril yang masing-masing berisi 225 ml NaCl 0.85 dan dihomogenisasi dengan stomacher 30 detik, 230 rpm, lalu
dituang ke dalam botol sampel. Setelah itu, SP diambil 1 ml dan diisolasi DNA-nya, sedangkan SPS diencerkan hingga tingkat
pengenceran 10
-6
kemudian dari seluruh tingkat pengenceran
34 diambil 1 ml untuk diisolasi DNA-nya dan diambil 0.1 ml untuk
diiinokulasikan pada MYPA dan dihitung koloni B. cereus yang tumbuh. Pengamatan dan penghitungan koloni dilakukan setelah
MYPA diinkubasi 37ºC selama 2 hari. Perhitungan koloni tipikal B. cereus mengikuti hitungan cawan USFDA, 2001.
Koloni tipikal B. cereus pada MYPA adalah koloni pink cerah dan dikelilingi zona presipitasi. Cawan yang digunakan
untuk perhitungan ialah cawan dengan koloni tipikal berkisar antara 15-150 koloni. Perhitungan jumlah koloni per ml
dilakukan dengan Standard Plate Count BAM edisi ke-8 dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan: N = jumlah koloni per ml atau per g produk ∑C = jumlah semua koloni yang dihitung
n1 = jumlah cawan pada pengenceran pertama n2 = jumlah cawan pada pengenceran kedua
d = pengenceran pertama yang dihitung
b. Tahap isolasi DNA
Kategori