38 selama 5 detik. Lalu ditambahkan 5 µL RNAse-A, divorteks
dan disentrifus 5000 rpm selama 5 detik. Sampel kembali diinkubasi pada suhu kamar 25ºC selama 15 menit. Setelah itu,
ditambahkan 500 µl buffer lisis, divorteks selama 10 detik dan inkubasi pada suhu kamar 25ºC selama 5 menit. Setelah itu,
cairan dipindahkan ke dalam kolom mini yang diletakkan di dalam collection tube dan disentrifus pada 15000 rpm selama
1 menit, lalu cairan pada collection tube dibuang dan kolom diletakkan pada collection tube.
Sebanyak 500 µL buffer lisis ditambahkan ke dalam kolom mini dan disentrifus 15000 rpm selama 1 menit, kemudian
cairan pada collection tube dibuang kembali dan kolom diletakkan kembali ke dalam collection tube. Setelah itu, ke
dalam kolom mini ditambahkan 500 µL wash buffer dan disentrifus dengan kecepatan 14000 rpm selama 3 menit,
kemudian collection tube dan kolom mini dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus baru. Sebanyak 200 µL buffer elusi
70
o
C ditambahkan ke dalam matriks fiber dalam kolom mini, lalu diinkubasi pada suhu kamar 25ºC selama 1 menit dan
disentrifus pada 14000 rpm selama 1 menit. Cairan pada tabung mikrosentrifus digunakan sebagai isolat DNA. Prosedur kerja
metode isolasi DNA dengan kit komersial dapat dilihat pada Lampiran 8.
c. Tahap amplifikasi Alarcon et al., 2006 dengan modifikasi
Sebanyak 2.0 µl isolat DNA, yang diperoleh dari 8 tingkat pengenceran untuk kultur murni, 1 tingkat pengenceran SP, dan
6 tingkat pengenceran SPS, digunakan sebagai templat untuk amplifikasi PCR. Isolat DNA 2.0 µl dicampur dengan 9.5 µl
RNAse free water, 12.5 µl SYBR Green supermix, 0.5 µl masing- masing forward dan reverse primer BceT. Volume total larutan
adalah 25 µl.
39 Larutan tersebut diamplifikasi dengan kondisi, sebagai berikut:
predenaturasi 95°C selama 10 menit, denaturasi pada suhu 95°C selama 10 detik dan penempelan pada suhu 55°C selama 30 detik
40 siklus dengan thermal cycler iCycler IQ System, dilanjutkan dengan 80 siklus suhu 55°C selama 10 detik untuk menghasilkan
melt curve yang digunakan dalam spesifisitas uji.
Kondisi amplifikasi menurut Alarcon et al. 2006 yaitu denaturasi pada suhu 95°C selama 15 detik dan penempelan pada
suhu 60°C selama 1 menit dengan thermal cycler GeneAmp 5700 Sequence Detection System dimodifikasi menjadi kondisi seperti
yang dijelaskan di atas untuk menyesuaikan dengan jenis primer dan thermal cycler
yang digunakan sehingga amplifikasi dapat berlangsung.
Primer forward dan reverse BceT dianalisis dengan Basic Local Alignment Search Tool
BLAST, NCBI untuk mengetahui spesifitasnya terhadap gen target. Urutan nukleotida sepasang primer
tersebut adalah 5’-GAA TTC CTA AAC TTG CAC CAT CTC G-3’ untuk forward primer yang terletak pada urutan basa nukleotida
2208-2232 pada DNA kromosomal B. cereus dan 5’-CTG CGT AAT CGT GAA TGT AGT CAA T-3’ reverse primer yang terletak
pada urutan basa nukleotida 1587-1611 pada DNA kromosomal B. cereus
. Produk amplifikasi dari sepasang primer ini adalah 646 pasang basa.
d. Evaluasi kinerja
real-time PCR
Amplifikasi real-time PCR dilakukan untuk menetapkan limit deteksi kultur murni B. cereus dan limit deteksi B. cereus pada nasi
goreng. Selain itu, real-time PCR dapat digunakan untuk menghasilkan melt curve. Kurva tersebut dipakai dalam spesifisitas
uji. Kinerja real-time PCR dievaluasi dengan cara menetapkan limit
deteksi, sensitivitas dan spesifisitas uji.
40 1
Limit deteksi Isolat DNA kultur murni dengan beberapa tingkat
pengenceran diamplifikasi dan diperoleh nilai Ct dari masing- masing pengenceran serta kurva standar. Pengenceran tertinggi
yang masih dapat teramplifikasi merupakan limit deteksi kultur murni B. cereus dalam penelitian ini. Kurva standar memberikan
persamaan linear yang digunakan untuk mengukur limit deteksi B. cereus
dalam sampel pangan. Persamaan linear kurva standar digunakan untuk menghitung konsentrasi bakteri yang belum
diketahui dalam sampel pangan. Konsentrasi B. cereus pada sampel pangan nasi goreng dapat dihitung dengan memasukkan
nilai Ct hasil amplifikasi sebagai nilai y pada persamaan linear, kemudian nilai yang diperoleh diantilogkan.
Limit deteksi dengan real-time PCR memiliki satuan CFUml atau CFUg. Oleh karena itu, setiap isolasi DNA
dilakukan, pencawanan pada media selektif dari beberapa pengenceran juga dilakukan untuk mengetahui jumlah koloni
pada kultur murni atau pun koloni pada sampel pangan. Prosedur penetapan limit deteksi bakteri patogen dengan PCR
dapat dilihat pada Lampiran 9. 2
Spesifisitas uji Primer
BceT diuji spesifisitasnya dengan cara
membandingkan melting temperature Tm dari puncak melt curve
yang terbentuk antara amplikon yang diperoleh dari isolat DNA B. cereus dan amplikon yang diperoleh dari isolat DNA
B. subtilis . Hasil amplifikasi amplikon yang spesifik
ditunjukkan dengan nilai Tm yang sama pada puncak melt curve
. Tm merupakan suhu peleburan di mana 50 DNA untai ganda telah terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Secara
teoritis, Tm amplikon dari isolat DNA B. cereus dan B. subtilis berbeda karena DNA target merupakan DNA spesifik dari
B. cereus .
41
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. IDENTIFIKASI SEROVAR Salmonella spp.