analysis , kondroitin sulfat for analysis dari trakea sapi dengan tingkat kemurnian
≥60 yang dibeli dari Sigma Aldrich dan kertas indikator pH.
3.3 Prosedur Penelitian
Penelitian ini terdiri dari dua tahapan, yaitu preparasi dan karakterisasi tulang rawan ikan pari dan ekstraksi enzimatis serta analisis konsentrasi
glikosaminoglikan.
3.3.1 Preparasi dan karakterisasi tulang rawan
Preparasi tulang rawan ikan pari mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Mizuta et al. 2003 yaitu ikan pari yang telah dibekukan lebih dari 24 jam,
dipotong pada bagian sirip pektoralnya. Daging selanjutnya dipisahkan dengan cara dikikis menggunakan pisau hingga didapatkan tulang rawan utuh. Aktivitas
selanjutnya adalah pembersihan daging pada tulang rawan berdasarkan Murado et al
. 2010. Kegiatan yang dilakukan adalah merebus tulang rawan selama 20 menit di dalam panci berisi air dengan suhu 80°C. Sisa daging dibersihkan dengan
cara disikat dan dicuci dengan air mengalir. Tulang rawan yang telah bersih dari sisa-sisa lemak dan daging selanjutnya disimpan beku pada suhu ±20
o
C. Karakterisasi tulang rawan ikan pari mengacu pada penelitian
Kittiphattanabawon et al. 2010. Karakterisasi tulang rawan terdiri dari analisis- analisis yang meliputi analisis kadar air dan abu AOAC 2005 serta analisis
komposisi asam amino dengan metode High Performance Liquid Chromatography
HPLC. 3.3.2
Ekstraksi enzimatis
Lignot et
al. 2003
dan dialisis
Garnjanagoonchorn et al. 2007
Ekstraksi tulang rawan dilakukan secara enzimatis diawali dengan pengecilan ukuran dan pengeringan tulang rawan hasil preparasi. Pengeringan
tulang rawan mengacu pada penelitian Ndife et al. 2010. Kondisi pencacahan yang dilakukan adalah menggunakan blender pada suhu ruang, sedangkan kondisi
pengeringan yang dilakukan adalah dengan menggunakan oven pada suhu 40
o
C selama 6 jam.
Ekstraksi dilakukan dengan cara mempersiapkan sampel tulang rawan yang telah dikeringkan sebanyak 11,25 g untuk selanjutnya disuspensikan dalam
air hingga 125 mL. Kemudian dilakukan penambahan enzim papain sebanyak
0,25 g. Ekstraksi berlangsung pada pH 6,5 dan suhu ±65°C selama 3 jam kondisi efektif terhadap waktu dan hasil ekstraksi berdasarkan Lignot et al. 2003 yang
telah dikembangkan dari Scott 1969 untuk menghasilkan kondroitin sulfat dengan konsentrasi berkisar 1,3 g100 mL serta berdasarkan Garnjanagoonchorn
et al . 2007 pada ekstraksi enzimatis kondroitin sulfat dari sirip hiu dan tulang
rawan pari Dasyatis zugei dengan konsentrasi kondroitin sulfat yang dihasilkan dari masing-masing sumber sebesar 1,5 g100 mL dan 0,749 g100 mL.
Pemisahan protein mengacu pada penelitian Garnjanagoonchorn et al. 2007. Pada hasil ekstraksi selanjutnya ditambahkan asam trikloroasetat TCA
untuk dipisahkan proteinnya. Asam trikloroasetat ditambahkan ke dalam larutan hasil hidrolisis enzimatis hingga konsentrasinya mencapai 7 bv. Campuran
tersebut didiamkan selama semalam pada suhu 4°C, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 132.000 x g selama 30 menit pada suhu 4°C untuk memisahkan protein
yang mengendap. Supernatan yang dihasilkan dari proses ini selanjutnya didialisis dalam akuades dingin selama 24 jam. Proses ini bertujuan untuk memisahkan
glikosaminoglikan GAGs dari garam-garam yang masih tercampur dalam larutan. Konsentrasi glikosaminoglikan diuji dengan spektrofotometri
menggunakan sulfate GAGs assay yang mengacu Jong et al. 1989 dan Zhou et al
. 2002 yang dimodifikasi. Larutan hasil dialisis kemudian diberi perlakuan pengeringan dengan evaporator vakum sehingga didapatkan glikosaminoglikan
dalam bentuk serpihan halus. Spektrum gugus fungsi glikosaminoglikan selanjutnya dianalisis menggunakan Fourier Transform Infra-Red FTIR
spektrofotometri Garnjanagoonchorn et al. 2007.
3.4 Prosedur Pengujian
