0,25 g. Ekstraksi berlangsung pada pH 6,5 dan suhu ±65°C selama 3 jam kondisi efektif terhadap waktu dan hasil ekstraksi berdasarkan Lignot et al. 2003 yang
telah dikembangkan dari Scott 1969 untuk menghasilkan kondroitin sulfat dengan konsentrasi berkisar 1,3 g100 mL serta berdasarkan Garnjanagoonchorn
et al . 2007 pada ekstraksi enzimatis kondroitin sulfat dari sirip hiu dan tulang
rawan pari Dasyatis zugei dengan konsentrasi kondroitin sulfat yang dihasilkan dari masing-masing sumber sebesar 1,5 g100 mL dan 0,749 g100 mL.
Pemisahan protein mengacu pada penelitian Garnjanagoonchorn et al. 2007. Pada hasil ekstraksi selanjutnya ditambahkan asam trikloroasetat TCA
untuk dipisahkan proteinnya. Asam trikloroasetat ditambahkan ke dalam larutan hasil hidrolisis enzimatis hingga konsentrasinya mencapai 7 bv. Campuran
tersebut didiamkan selama semalam pada suhu 4°C, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 132.000 x g selama 30 menit pada suhu 4°C untuk memisahkan protein
yang mengendap. Supernatan yang dihasilkan dari proses ini selanjutnya didialisis dalam akuades dingin selama 24 jam. Proses ini bertujuan untuk memisahkan
glikosaminoglikan GAGs dari garam-garam yang masih tercampur dalam larutan. Konsentrasi glikosaminoglikan diuji dengan spektrofotometri
menggunakan sulfate GAGs assay yang mengacu Jong et al. 1989 dan Zhou et al
. 2002 yang dimodifikasi. Larutan hasil dialisis kemudian diberi perlakuan pengeringan dengan evaporator vakum sehingga didapatkan glikosaminoglikan
dalam bentuk serpihan halus. Spektrum gugus fungsi glikosaminoglikan selanjutnya dianalisis menggunakan Fourier Transform Infra-Red FTIR
spektrofotometri Garnjanagoonchorn et al. 2007.
3.4 Prosedur Pengujian
Analisis sampel yang dilakukan terdiri dari analisis kadar air dan kadar abu tulang rawan, komposisi asam amino tulang rawan, tingkat konsentrasi
glikosaminoglikan, dan analisis FTIR glikosaminoglikan.
3.4.1 Analisis kadar air AOAC 2005
Analisis kadar air dilakukan dengan penguapan menggunakan oven. Tahap pertama yang dilakukan adalah mengeringkan cawan porselen pada
suhu 102-105
o
C selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan dalam desikator kurang lebih 15 menit hingga dingin kemudian ditimbang. Cawan dimasukkan sampel
sebanyak 5 gram kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 102-105
o
C selama 6 jam. Setelah 6 jam cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator
hingga dingin kemudian ditimbang bobotnya. Rumus perhitungan kadar air dapat ditulis sebagai berikut:
Kadar air = B
− C B
− A x 100
Keterangan: A = Berat cawan kosong gram B = Berat cawan yang diisi sampel gram sebelum dioven
C = Berat cawan dengan sampel gram setelah dioven
3.4.2 Analisis kadar abu AOAC 2005
Analisis kadar abu dilakukan dengan mengabukan sampel di dalam tanur. Tahap pertama cawan abu porselen dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada
suhu 105
o
C, lalu didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Sampel ditimbang sebanyak 5 gram dan dimasukkan ke dalam cawan pengabuan yang
akan dipijarkan di atas nyala api bunsen hingga tidak berasap lagi. Sampel sebanyak 5 gram tersebut dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu
600
o
C selama 6 jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih. Setelah itu cawan
didinginkan dalam desikator selam 30 menit, kemudian ditimbang bobotnya. Rumus perhitungan kadar abu dapat ditulis sebagai berikut:
Kadar abu = C
− A B
− A x 100
Keterangan: A = Berat cawan kosong gram B = Berat cawan yang diisi sampel gram sebelum ditanur
C = Berat cawan dengan sampel gram setelah ditanur
3.4.3 Analisis asam amino dengan metode High Performance Liquid
Chromatography HPLC Millipore Corp. 1993
Jumlah asam amino pada tulang rawan ikan pari ditentukan melalui uji asam amino menggunakan metode HPLC. Analisis asam amino dilakukan
menggunakan kolom AccQtag 3,9x150 mm. Fase gerak yang digunakan adalah Asetonitril dan AccqTag Eluent A 60:40 dengan sistem eluen gradien
komposisi. Laju alir 1 mLmenit dengan volume pen yuntikan 5 μL dan suhu
kolom 37°C. Detektor yang digunakan adalah fluorescence dengan panjang
gelombang eksitasi 250 nm dan emisi 395 nm. Derivatisasi asam amino dengan menggunakan 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate AQC untuk
menghasilkan fluoresens yang stabil AQC-asam amino yang siap digunakan untuk analisis pada HPLC. Separasi AQC-asam amino tercapai melalui
kombinasi pada perubahan konsentrasi asetonitril dan garam.
3.4.4 Analisis konsentrasi
