KARAKTERISASI ISOLAT PROTEOLITIK HASIL DAN PEMBAHASAN

15

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. KARAKTERISASI ISOLAT PROTEOLITIK

Pada penelitian terdahulu yang dilakukan oleh Dewi 2011, telah diseleksi dua jenis bakteri proteolitik yang berasal dari kotoran luwak. Bakteri tersebut adalah FLP 1 dan FLP 2. kedua jenis bakteri mampu tumbuh pada media skim milk akan tetapi kedua jenis bakteri belum dikarakterisasi sehingga untuk memilih bakteri proteolitik sebagai isolat untuk fermentasi padat kopi kedua jenis bakteri ini perlu dikarakterisasi. Menurut Akhdiya 2003, adanya mikroorganisme yang unggul merupakan salah satu faktor penting dalam usaha produksi enzim.Karakterisasi kedua bakteri ini dilakukan dengan pengamatan terhadap kurva pertumbuhan, aktivitas enzim, kadar protein, aktivitas spesifik, dan jumlah sel sehingga diperoleh bakteri terbaik yang dapat dimanfaatkan untuk proses fermentasi kopi. Mikroorganisme produsen protease seperti bakteri asam laktat akan tumbuh baik pada suhu antara 30 o C sampai 40 o C. Pada suhu dibawah 30 o C pertumbuhan bakteri pembusuk lebih tinggi dibandingkan bakteri asam laktat. Dalam proses fermentasi menggunakan bakteri proteolitik, penggunaan suhu yang baik adalah pada selang 30 o C sampai 40 o C sehingga enzim protease akan di produksi secara optimum Muthulakshmi et al 2011. Karakterisasi isolat FLP 1 dan FLP 2 dilakukan pada suhu 30 o C untuk mendapatkan hasil pertumbuhan dan produksi protease optimum dari kedua isolat tersebut. Selain itu penggunaan suhu 30 o C dalam karakterisasi protease tidak memerlukan inkubator untuk menaikkan dan menurunkan suhu sehingga dapat mengurangi biaya operasi karena karena suhu ruangan tanpa adanya Air Conditioning AC + 30 o C. Menurut Waluyo 2004, k urva tumbuh merupakan grafik yang menunjukkan tingkat pertumbuhan mikroorganisme persatuan waktu. Tingkat pertumbuhan terukur berdasarkan tingkat kekeruhan yang mampu menyerap cahaya absorbansi. Kurva pertumbuhan FLP 1 dan FLP 2 Gambar 2, menunjukkan pada waktu inkubasi 0 jam hingga 24 jam bakteri FLP 1 mengalami fase log sedangkan fase log bakteri FLP 2 terjadi pada waktu inkubasi 0 hingga 18 jam. Fase tersebut ditunjukkan oleh pertumbuhan sel yang cepat karena masih tersedianya nutrisi yang banyak. Puncak fase log bakteri FLP 1 adalah pada saat nilai optical density OD sebesar 0.633 dengan tingkat pengenceran 5 kali, sedangkanpuncak fase log bakteri FLP 2 adalah pada saat nilai optical density OD sebesar 0.542 dengan tingkat pengenceran 5 kali.Setelah waktu inkubasi 24 jam, bakteri FLP 1 mengalami fase stasioner, sedangkanbakteri FLP 2 setelah jam ke-18 bakteri FLP 2 juga mengalami fase stasioner. Pada fase ini nutrisi yang tersedia sudah mulai berkurang dan sel masih terus membelah. Puncak pertumbuhan bakteri FLP 1 adalah pada saat OD 0.698 pada jam ke-42, untuk bakteri FLP 2 OD tertinggi adalah 0.649 pada jam ke-42. Pada waktu inkubasi setelah 42 jam, kedua bakteri mengalami fase kematian dimana pada fase ini sel kehabisan nutrien untuk tumbuh dan membelah sehingga pertumbuhan sel cenderung menurun. Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba adalah tersedianya nutrien, air, suhu, pH, oksigen, potensial oksidasi reduksi, adanya zat-zat penghambat, dan adanya jasad renik lain. Mikroba membutuhkan nutrient untuk kehidupan dan pertumbuhannya sebagai sumber karbon, sumber nitrogen, sumber energi dan faktor pertumbuhan lain seperti vitamin dan 16 mineral. Nutrien tersebut dibutuhkan untuk membentuk energi dan menyusun komponen- komponen sel Waluyo, 2004. Gambar 3. Kurva tumbuh bakteri FLP 1 dan FLP 2 Hasil pengujian aktivitas proteolitik menunjukkan bakteri FLP 1 dan FLP 2 aktif menghasilkan protease selama pertumbuhannya. Pada grafik Gambar 4 dapat dilihat bakteri FLP 1 memiliki aktivitas proteolitik secara kuantitatif yang tertinggi sebesar 1,4 Uml dengan waktu inkubasi 24 jam, sedangkan bakteri FLP2 memiliki aktivitas proteolitik secara kuantitatif yang tertinggi sebesar 0.6 Uml dengan waktu inkubasi 18 jam. Jika dihubungkan antara kurva pertumbuhan bakteri dengan uji aktivitas proteolitik dapat dilihat bahwa pada fase pertumbuhan cepat bakteri FLP 1 menghasilkan aktivitas proteolitik tinggi yang dicapai pada selang waktu inkubasi18 – 24 jam, sedangkan bakteri FLP 2 menghasilkan aktivitas proteolitik tinggi yang dicapai pada selang waktu inkubasi12 – 18jam Hal ini disebabkan masih tersedianya nutrisi dalam jumlah besar yang diperlukan sel bakteri untuk melakukan metabolisme sel, sehingga jumlah log sel bakteri juga mengalami peningkatan. Dari grafik aktivitas enzim Gambar 4, dapat dilihat bahwa aktivitas proteolitik bakteri FLP 1 pada waktu inkubasi 0 hingga 24 jam semakin meningkat serta diiringi dengan meningkatnya kurva pertumbuhan bakteri dan untuk bakteri FLP 2 pada waktu inkubasi 0 hingga 18 jam semakin meningkat serta diiringi dengan meningkatnya kurva pertumbuhan bakteri. Telah dijelaskan sebelumnya, pada waktu inkubasi hingga 24 jam bakteri FLP 1 dan hingga 18 jam bakteri FLP 2 mengalami fase log. Dimana pada fase ini bakteri membutuhkan nutrisi yang banyak untuk pertumbuhan dan pembelahan sel. Pada karakterisasi bakteri proteolitik ini nutrisi atau substrat yang digunakan adalah skim milk, dimana dapat dihubungkan dengan salah satu ciri enzim yaitu kekhususan yang tinggi terhadap substrat. Mekanisme reaksi enzimnya adalah enzim dan substrat akan bergabung menjadi kompleks enzim substrat, yang kemudian terurai menjadi produk. Enzim tersebut tidak terkonsumsi di dalam reaksinya tetapi dilepaskan kembali untuk reaksi selanjutnya. Proses ini diulang-ulang sampai semua molekul substansi yang tersedia habis terpakai. Banyak bakteri dapat menghancurkan protein di luar tubuhnya dan menggunakan produk hasil proses tersebut sebagai sumber tenaga karbon dan nitrogen. Karena molekul protein 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 O p ti c al D e n si ty Waktu Inkubasi jam FLP 1 FLP 2 17 terlampau besar untuk dapat melewati membran, bakteri mensekresikan protease yang menghidrolisis protein tersebut menjadi peptide-peptide. Bakteri menghasilkan peptidase yang menguraikan peptide menjadi asam-asam amino yang diperlukan untuk metabolisme Pelczar dan Chan, 2005. Pada grafik aktivitas proteolitik Gambar 4 juga dapat dilihat bahwa pada waktu inkubasi setelah 24 jam untuk bakteri FLP 1 dan setelah 18 jam untuk FLP 2, aktivitas proteolitik cenderung menurun tetapi kurva pertumbuhan bakteri masih meningkat. Hal ini dikarenakan adanya pengendalian aktivitas enzim yang diatur oleh ligan molekul yang dapat terikat oleh enzim yang tidak turut berperan dalam proses katalitik itu sendiri. Pengendalian aktivitas enzim yang dimaksud adalah hambatan arus-balik feed back inhibition. Pada hambatan arus balik, ligan pengaturnya adalah produk akhir suatu lintasan metabolik yang dapat menghentikan sintesisnya sendiri dengan cara menghambat aktivitas enzim. Produk akhir dari reaksi enzim disini adalah asam amino, dimana asam amino akan menghambat aktivitas protease. Jika asam amino yang dihasilkan menumpuk, maka mengakibatkan aktivitas enzim protease yang dihasilkan menurun Pelczar dan Chan, 2005. Penurunan aktivitas proteolitik ini juga dapat terjadi karena berkurangnya jumlah substrat yang akan menghambat pembentukan kompleks enzim substrat dan perubahan struktur enzim yang akan menyebabkan penurunan laju katalitik. Akibat perubahan struktur enzim, sisi aktif enzim mengalami perubahan bentuk sehingga tidak dapat digunakan secara baik dalam mengikat substrat Thomas 1989. ` Gambar 4. Aktivitas proteolitik FLP 1 dan FLP 2 Aktivitas spesifik proteolitik merupakan indikator untuk menunjukkan apakah kandungan protein pada media skim milk merupakan protein. Dari grafik aktivitas enzim spesifik protease Gambar 5, dapat dilihat peningkatan nilai aktivitas spesifik sesuai dengan peningkatan aktivitas enzim. Nilai aktivitas spesifik tertinggi untuk bakteri FLP 1 adalah 10.817 unitmg yang diperoleh pada waktu inkubasi 24 jam dan 5.436 unitmg untuk bakteri FLP 2 pada jam ke 18. Kadar protein untuk kedua bateri berada pada rentang yang berbeda. Rentang kadar protein selama inkubasi untuk bakteri FLP 1 0.121 - 0.139 mgml lebih besar dibanding dengan 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 A k ti v itas En z im U n it m l Waktu Inkubasi jam FLP 1 FLP 2 18 rentang kadar protein selama inkubasi bakteri FLP 2 0.083 – 0.098 mgml. Grafik kadar protein dapat dilihat pada Gambar 6. Gambar 5. Aktivitas spesifik FLP 1 dan FLP 2 Gambar 6. Kadar Protein FLP 1 dan FLP 2 Pertumbuhan bakteri FLP 1 dan bakteri FLP 2 juga dapat dilihat dari jumlah sel yang dapat dihitung dengan metode TPC. Hasil perhitungan jumlah sel setiap selang 6 jam waktu inkubasi dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. Total Plate Count TPC FLP 1 dan FLP 2 Jam ke Jumlah Sel FLP 1 CFUml Jumlah Sel FLP 2 CFUml Subkultur 134 x 10 7 288 x 10 7 6 53 x 10 6 178 x 10 6 12 78 x 10 6 187 x 10 6 18 194 x 10 7 51 x 10 7 24 256 x 10 7 44 x 10 8 30 56 x 10 8 170 x 10 8 36 200 x 10 8 144 x 10 9 42 67 x 10 9 245 x 10 7 48 61 x 10 8 33 x 10 6 54 284 x 10 7 - Berdasarkan kurva tumbuh dan aktivitas enzim dapat dilihat bahwa pertumbuhan beserta aktivitas protelitik optimum yang dimiliki bakteri FLP 1 lebih tinggi dibandingkan dengan pertumbuhan beserta aktivitas proteolitik optimum FLP 2. Bakteri FLP 1 lebih baik untuk digunakan sebagai isolat dalam fermentasi kopi. Waktu untuk menginokulaskan bakteri proteolitik pada kopi adalah setelah bakteri proteolitik berumur 18 jam karena pada waktu 18 jam bakteri FLP 1 memasuki fase pertumbuhan yang sangat cepat berdasarkan kurva tumbuh Gambar 2 dan produksi enzim protease juga berada pada kondisi yang optimum. 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 12 24 36 48 60 A k ti v itas En z im S p e si fi k u n it m g Waktu Inkubasi jam FLP 1 FLP 2 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 12 24 36 48 60 K ad ar P r o te in m g m l Waktu Inkubasi jam FLP 1 FLP 2 19

4.2. FERMENTASI PADAT KOPI