Karakterisasi Isolat Proteolitik METODE PENELITIAN

12

3.3.1. Karakterisasi Isolat Proteolitik

Karakterisasi isolat proteolitik dilakukan dengan pengukuran kurva tumbuh, aktivitas enzim, kadar protein dan perhitungan jumlah sel isolat yang ditumbuhkan pada media padat campuran 2,6 gram Nutrient Broth, 1 gram susu skim, dan 4 gram agar di cawan petri Lampiran 1. Pembuatan kurva tumbuh untuk kedua isolat proteolitik dilakukan dengan peremajaan isolat pada media agar-agar skim milk dicawan petri dan ditumbuhkan pada suhu ruangan selama ± 48 jam. Isolat yang terbentuk ditumbuhkan pada media cair skim milk untuk menentukan kurva pertumbuhan melalui pengukuran kekeruhan Optical Density setiap 6 jam menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Pengukuran aktivitas enzim protease dan kadar protein dilakukan dengan pembuatan inokulum yang dilakukan dengan mengambil 1-2 koloni dan ditumbuhkan dalam 10 ml media cair skim milk pada tabung reaksi, diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Sebanyak 1 ml inokulum dikultivasikan ke dalam masing-masing labu Erlenmeyer berisi 100 ml media cair skim milk. Inkubasi dilakukan pada shaker inkubator dengan kecepatan 100 rpm pada suhu ruang. Pengukuran aktivitas enzim dilakukan setiap 6 jam. Enzim ekstrak kasar diperoleh melalui sentrifugasi kultur pada 3000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 o C. Enzim ekstrak kasar digunakan untuk pengujian aktivitas enzim dan kadar protein. Enzim diukur dengan menghitung jumlah enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µg tirosin ekuivalenmenitml larutan enzim dari substrat kasein pada kondisi pengujian tersebut. Prosedur pengujian aktivitas enzim disajikan pada Lampiran 1. Kandungan protein di uji dengan metode Bradford 1976 dan menggunakan larutan BSA 0-1 mgml sebagai standar Lampiran 2. Selanjutnya perhitungan jumlah sel isolat proteolitik dihitung menggunakan metode Total Plate Count TPC. 3.3.2.Fermentasi Kopi Fermentasi kopi dilakukan dengan menginokulasikan 10 isolat yang telah mencapai fase eksponensialnya setelah ditumbuhkan pada media cair ke dalam campuran 5 gram kulit kopi dan 10 gram biji kopi. Kulit kopi dengan kadar air 40 yang telah dihaluskan hingga 40 mesh dan biji kopi dicampur dalam satu wadah kecil tertutup dan diinokulasikan isolat terpilih diinkubasi pada suhu 30 o C dan 37 o C. Jumlah isolat untuk perlakuan pertama adalah 10 FLX 3, perlakuan kedua 5 FLX 3 dan 5 FLP1, dan perlakuan ketiga 3.4 FLX 3, 3.3 FLP 1, dan 3.3 FLS 1. Analisa dilakukan setiap 24 jam sekali dan fermentasi dilakukan selama 84 jam. Khusus untuk analisa ke-4 dilakukan 12 jam setelah analisa ke-3. Adapun analisa yang dilakukan antara lain pengujian aktivitas enzim, pengujian cairan hasil fermentasi yang meliputi analisa gula total, gula pereduksi, kadar protein, dan pengamatan residu hasil fermentasi. Pengujian aktivitas enzim xilanase. Sebanyak 0.05 g kulit kopi ditambah 5 ml bufer phospat dan 5 ml enzim ekstrak kasar kemudian direaksikan di dalam labu erlenmeyer 100 ml pada suhu ruangan selama 60 menit. Selanjutnya campuran tersebut 13 disentrifugasi pada kecepatan 2860 rpm selama 25 menit pada suhu 4 o C. Sebanyak 1 ml supernatan diambil dan ditambahkan 1 ml DNS, lalu diinkubasi pada suhu 100 o C selama 15 menit. Sampel diukur aktivitas enzimnya dengan menghitung pembentukan gula sederhana dengan metode DNS Lampiran 3. Pengujian aktivitas protease dilakukan dengan metode Kunitz Lampiran 2. Dengan sampel yang dipakai adalah air saringan hasil fermentasi. Kopi yang sudah di fermentasi diencerkan dengan air sebanyak 75ml dan dipisahkan antara kulitdan biji. Pengujian cairan hasil fermentasi. Pengujian dilakukan untuk melihat terjadinya perubahan komposisi karbohidrat yaitu gula total, gula pereduksi, dan derajat polimerisasi DP pada cairan fermentasi Lampiran 3. Pengamatan residu hasil fermentasi .Analisis yang dilakukan meliputi pengamatan susut bobot kulit kopi dengan metode gravimetri dan mengamati perubahan struktur serat kulit kopi Lampiran 4. Kulit kopi yang telah terpisah dari cairan fermentasi dikeringkan dalam oven selama 24 jam. Kulit kopi yang telah kering ditimbang dan diamati perubahan strukturnya menggunakan mikroskop cahaya terpolarisasi pada perbesaran 200 kali. Pengamatan dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri dalam memecah struktur serat kulit kopi. Analisa asam-asam organik. Analisa dilakukan pada komponen asam-asam organik biji kopi terbaik berdasarkan hasil analisa aktivitas enzim, susut bobot, gula total, gula perduksi, dan derajat polimerisasi.yang meliputi asam askorbat, asam butirat, asam laktat, asam oksalat, dan kafein. Analisa dilakukan menggunakan metode gas kromatografi dimana pengerjaannya dilakukan oleh analis dari Balai Penelitian dan Pengembangan Pasca Panen Bogor. Analisa tidak dapat dilakukan sendiri karena alat yang dibutuhkan tidak tersedia di laboratorium tempat penelitian dilakukan. Gambar 2. Diagram alir proses fermentasi kopi 14 Rancangan percobaan yang digunakan untuk menentukan pengaruh faktor perlakuan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap faktorial multi taraf multy level factorial design dengan tiga variabel proses, yaitu isolat yang diinokulasikan P, suhu Q, dan waktu inkubasi R, setiap variabel memiliki taraf yang berbeda-beda, tiga taraf untuk variabel isolat, dua taraf untuk variabel suhu, dan empat taraf untuk variabel waktu inkubasi. Persamaan untuk rancangan tersebut adalah sebagai berikut : Y ijk = + P i + Q j + R k + PQ ij + PR ik + QR jk + PQE ijk + ε ijkl Keterangan : Y ijk = nilai pengamatan pada faktor A taraf ke-i, faktor B taraf ke-j dan ulangan ke-k = rataan umum respon P i = pengaruh utama faktor P taraf ke-i Q j = pengaruh utama faktor Q taraf ke-j R k = pengaruh utama faktor R taraf ke-k PQ ij = interaksi dari faktor P pada taraf ke-i dan faktor Q pada taraf ke-j PR ik = interaksi dari faktor P pada taraf ke-i dan faktor R pada taraf ke-k QR jk = interaksi dari faktor Q pada taraf ke-j dan faktor R pada taraf ke-k PQR ijk = interaksi dari faktor P pada taraf ke-i, Q pada taraf ke-j dan faktor R pada taraf ke-k ε ijkl = pengaruh acak yang menyebar normal 0,σ 2 15

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN