6
tersebut pahit. Kopi luwak memiliki rahasia kenikmatan yang menjadikan kopi tersebut paling nikmat di dunia. Ternyata sumber kenikmatan ini terletak pada proses fermentasi di dalam perut
luwak. Proses terbentuknya feses luwak berupa “gumpalan” biji kopi dimulai saat buah kopi yang sudah matang berwarna merah dimakan oleh luwak musang. Di dalam perutnya, buah
kopi diuraikan oleh enzim proteolitik. Secara umum komponen pada kopi yang diuraikan dalam perut luwak antara lain protein, selulosa, xilan, dan beberapa mineral. Kenikmatan kopi luwak
juga dipengaruhi oleh faktor berbagai rangkaian proses fermentasi dan pengolahannya. Adapun faktor tersebut adalah sebagai berikut :
1. Buah yang dikonsumsi oleh luwak merupakan buah kopi yang sudah matang optimal yang
kemudian akan disortir kembali oleh luwak berdasarkan indera penciumannya. 2.
Proses pengupasan kulit buah oleh sistem pencernaan luwak hasilnya lebih baik dibandingkan dengan pengupasan kulit buah menggunakan proses pengolahan kering atau
pengolahan basah oleh manusia. 3.
Proses fermentasi pelepasan senyawa lendir yang terdapat pada kulit tanduk biji kopi berjalan sempurna oleh sistem pencernaan luwak.
4. Tempering atau pendinginan secara bertahap atau perlahan-lahan dapat membantu proses
fermentasi sempurna. Dengan mengeringkan feses dengan cara mengangin-anginkan akan menghasilkan kopi yang lebih baik.
Karena berbagai proses dan faktor di atas, menjadi kopi luwak sangat sulit diproduksi secara besar-besaran. Dengan demikian harga kopi luwak juga menjadi sangat mahal, bahkan menjadi
kopi termahal di seluruh dunia. Kepopulerannya telah merambah ke seluruh penjuru dunia karena rasanya
yang sangat “spesial” tersebut Pangabean 2011.
2.3. BAKTERI XILANOLITIK, SELULOLITIK, DAN PROTEOLITIK
Mikroorganisme memiliki peran yang cukup besar dalam siklus berbagai unsur seperti siklus karbon, nitrogen, fosfor, belerang dan unsur yang lain. Peran mikroorganisme menjadi
penting karena dapat menjaga keseimbangan unsur-unsur yang ada di alam Akhdiya 2003. Dari hasil penelitian terdahulu yang dilakukan Sri Laksmi Dewi pada tahun 2011,
dijelaskan bahwa pada kotoran luwak ada tiga kelompok besar bakteri yang berhasil diseleksi pada jenis-jenis media berbeda yaitu bakteri selulolitik FLS 1, xilanolitik FLX 3, dan
proteolitik FLP 1 dan FLP 2.Bakteri selulolitik merupakan bakteri yang mampu menghasilkan enzim selulase sehingga mampu mendegradasi selulosa.Bakteri xilanolitik merupakan bakteri
yang mampu menghasilkan enzim xilanase sehingga mampu mendegradasi xilan.Bakteri proteolitik merupakan bakteri yang mampu menghasilkan enzim protease sehingga mampu
mendegradasi protein.Setiap bakteri yang telah lolos seleksi memiliki karakteristk yang berbeda- beda seperti aktivitas enzin, aktivitas enzim spesifik, dan kurva tumbuh.Dari ketiga kelompok
bakteri tersebut bakteri yang berhasil di karakterisasi hanya bakteri xilanolitik dan selulolitik. Hasil karakterisasi, berdasarkan kurva tumbuh maka dapat dilihat fase eksponesial untuk bakteri
selulolitik adalah pada jam ke 18-22 sedangkan waktu awal untuk mengisolasikan bakteri xilanolitik dalam fermentasi kopi adalah pada jam ke 20-24. Dari hasil identifikasi ketiga bakteri
diketahui bahwa FLX 3 adalah Stenotropomonas sp MH34, FLS 1 adalah Proteus penneri, FLP 1 adalah Bacillus aerophilus, dan FLP 2 adalah Stenotropomonas sp MH3.
7
2.4. ENZIM XILANASE, SELULASE DAN PROTEASE
Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun atas serangkaian asam amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim dapat dimanfaatkan untuk berbagai
keperluan industri. Jenis atau macam-macam enzim yang ada saat ini sudah cukup banyak dan penggunaanya juga sudah cukup luas. Beberapa enzim yang banyak digunakan antara lain enzim
selulase, xilanase, pektinase, protease, enzim pendegradasi lemak dan lain-lain Richana et al 2004.
Enzim xilanase merupakan enzim kompleks yang terdiri atas 1,4- β-endoxilanase, β-
xilosidase, α-L-arabinofuranosidase, α-glukuronidase, asetil xilan esterase dan asam fenolat asam ferulat dan asam fumarat esterase. Salah satu persyaratan utama menggunakan susbtrat
untuk produksi xilanase adalah kandungan xilan yang tinggi, yang biasanya ditunjukkan oleh kandungan hemiselulosanya. Xilan merupakan hemiselulosa yang merupakan polimer dari
pentosa atau xilosa dengan ikatan ß-1,4 yang jumlah monomernya berkisar 150-200 unit. Hemiselulosa sendiri merupakan polimer dari monomer gula gula-gula anhidro yang dapat
dikelompokkan menurut penyusunnya yaitu heksosa glukosa, manosa dan galaktosa, pentosa xilosa, arabinopiranosa, arabinofuranosa, asam heksuronat glukoronat, metilglukoronat dan
galakturonat dan deoksi heksosa rhamnosa dan fruktosa. Rantai utama hemiselulosa dapat hanya terdiri atas satu macam monomer saja homopolimer, misalnya xilan, atau dapat terdiri
dua atau lebih monomer heteropolimer, misalnya glukomanan Kulkarni et al., 1999.. Menurut Richana 2007 , kebanyakan xilanase murni hanya memiliki satu aktivitas,
namun beberapa lignoselulolitik enzim dilaporkan memiliki spesifisitas substrat yang luas. Semula diduga hal itu disebabkan oleh tidak murninya enzim dan substratnya. Namun penelitian
lebih mendalam menunjukkan bahwa beberapa enzim yang dimasukkan dalam famili 16; 52 dan 62 merupakan enzim bifungsional yang memiliki 2 katalitik domain dimana salah satunya
merupakan katalitik domain dari xilanase famili 10 atau 11. Xilanase juga diketahui memiliki aktivitas lain selain aktivitas xilosidase. Xilanase
Clostridium stercorarium mampu menghidrolisis substrat p-NP- β-D-xilopiranosida dan p-NP-α-
L-arabinopiranosida Xilanase Clostridium cellulovorans diketahui memiliki aktivitas glikosil hidrolase famili 11 dan asetilxilan esterase. Kecambah Hordeum vulgare
L menghasilkan β-D- xilosidase dan α-L-arabinofuranosidase dengan BM yang sama 67 kDa tetapi memiliki pI
berbeda. Masing-masing enzim tersebut dapat menghidrolisa substrat p-NP- β-D-xilosida dan p-
NP- α-L-arabinofuranosida tetapi efesiensi katalitiknya berbeda. Aktivitas β-D-xilosidase
terhadap p-NP- β-D-xilosida 30 kali lipat aktivitasnya terhadap p-NP-α-L-arabinofuranosida,
sedangkan aktivitas α-L-arabinofuranosidase terhadap p-NP-α-L-arabinofuranosida hanya sedikit lebih tinggi dibandingkan aktivitasnya terhadap p-NP-
β-D-xilosida. Xilanase Xyl2 dan Xyl3 Streptomyces sp. strain S38 juga mampu menghidrolisa substrat p-NP-xilosida dan p-NP-
selobiosida sedangkan Xyl1 tidak Sanghi et al 2009. Struktur dasar molekul selulosa adalah suatu polimer yang tersusun dari 8 sampai 12
ribu unit glukosa yang masing-masing diikat oleh β-1,4-glikosidik Enari 1983 didalam Fikrinda
et al. 2000. Ikatan glikosidik tersebut pada serat selulosa dapat dipecah menjadi monomer glukosa. Proses pengubahannya dilakukan dengan cara hidrolisis asam atau secara biologis
melalui aktivitas enzim selulase Hardjo et al., 1989. Enzim selulase dikelompokkan berdasarkan spesifisitas aktivitasnya terhadap substrat yaitu endoglukanase, selobiohidrolase,
dan eksoglukohidrolase. Ketiga enzim tersebut bekerja sama dalam mengurai selulosa.
8
Bagian amorf selulosa dapat dihidrolisis dengan cepat, dan kecepatan hidrolisis ini akan menurun karena semakin banyaknya daerah kristal pengikat selulosa. Enzim endoglukanase
CMC-ase bekerja pada bagian amorf selulosa yang sangat mudah mengalami hidrolisis. Kecepatan hidrolisis senyawa komplek seperti selulosa oleh selulase, ditekankan kepada
aktivitas glukanase atau endoglukanase yang merupakan salah satu komponen utama dari enzim selulase dan mampu menghidrolisis ikatan β-1,4-glikosidik secara acak Enari 1983 didalam
Fikrinda et al. 2000. Enzim glukanase tidak memutus ikatan selobiosa, tetapi menghidrolisis selodekstrin. Glukanase juga menghidrolisis selulosa yang sebelumnya telah dihidrolisis
ikatannya oleh asam fosfat menjadi ikatan selulosa yang mudah tersubstitusi, contohnya adalah carboxymethylcellulose CMC dan hydroxyethyl-cellulose HEC.
Akses enzim selulase terhadap selulosa pada lignoselulosa menjadi yang penting dalam degradasi selulosa. Selulosa memiliki akses baik eksternal dipengaruhi oleh bentuk dan
ukuran particle dan internal struktur kapiler pada fibers. Pada lignoselulosa yang tidak dilakukan pretreatment hanya sedikit pori yang dapat digunakan sebagai akses enzim selulase
terhadap sustrat. Pada pretreatment yang dilakuan untuk menghilangkan hemiselulosa menunjukan terjadi peningkatan pori dan terdapat permukaan spesifik. Hasil hidrolisis berkaitan
dengan volume pori yang digunakan dalam akses enzim selulase. Pada beberapa penelitian diketahui bahwa pengeringan lignoselulosa menurunkan kapileritas sel dan menurunkan pori
sehingga menurunkan efektifitas enzim selulase. Kandungan lignin dalam lignoselulosa dan persebarannya mempengaruhi degradasi selulosa. Kemampuan degradasi selulosa oleh bakteri
berbeda dengan kemampuan degradasi fungi dalam mendegradasi selulosa. Bakteri memiliki kecenderungan untuk mendegradasi selulosa crystalline dibandingkan dengan sisi amorphous,
dan kemampuan ini dimiliki oleh hampir semua bakteri pendegradasi selulosa baik secara aerob atau anaerob. Namun karena selulosa crystalline tidak dapat didegradasi oleh enzim selulase
tunggal karena sifat selulosa crystalline yang rigrid, maka diduga degradasi selulosa crystalline dilakukan lebih dari satu enzim. Sedangkan fungi memiliki kecenderungan untuk mendegrdasi
selulosa pada sisi amorphous dibandingkan dengan sisi crystalline Palonen 2004. Protease merupakan enzim kompleks yang bekerja dalam proses hidrolisis molekul
protein. Protease adalah kelompok enzim penting dalam industri, terhitung sebanyak 60 dari penjualan enzim protease di seluruh dunia karena protease memiliki potensi yang sangat berguna
dalam industri. Enzim protease diklasifikasikan sebagai asam, enzim netral dan basa berdasarkan pH. Pada saat ini protease telah diproduksi dengan dua metode, yaitu fermentasi gabungan
fermentasi substarat padat dan cair yang biasa disebut dengan SmF Submerged Fermentation dan fermentasi substrat padat atau biasa disebut SSF Solid State Fermentation Radhaet al
2012.
Enzim protease dapat dihasilkan oleh tanaman, hewan maupun mikroorganisme. Enzim yang berasal dari tanaman maupun hewan memiliki kelemahan apabila digunakan atau
diproduksi, hal tersebut dikarenakan jaringan pada tanaman mengandung bahan yang berbahaya, seperti senyawa fenolik, faktor fisiologi pada organisme yang membutuhkan waktu sangat lama
dan adanya inhibitor enzim. Enzim protease yang digunakan dalam bidang industri umumnya diproduksi dari mikroorganisme. Penggunaan mikroorganisme untuk produksi enzim protease
mempunyai beberapa kelebihan, diantaranya mudah diproduksi dalam skala besar, waktu produksi relatif pendek serta dapat diproduksi secara berkesinambungan dengan biaya yang
relatif rendah Thomas 1989.
9
Menurut Akhdiya 2003, adanya mikroorganisme yang unggul merupakan salah satu faktor penting dalam usaha produksienzim. Oleh karena itu, eksplorasi mikroorganisme yang
berpotensi sebagai penghasil protease perludilakukan di Indonesia. Keragaman hayati Indonesia yang tinggi memberikan peluang yang besar untuk mendapatkan mikroorganisme yang potensial
untuk dikembangkan sebagai penghasil enzim protease. Medium yang mengandung kasein merupakan substrat yang baik untuk mengisolasi
bakteri penghasil enzim protease dan menginduksi sintesis enzim protease alkalin . Media yang digunakan untuk skrining bakteri penghasil protease adalah media padat dengan komposisi sama
media isolasi, tetapi ditambah skim milk 2. Sterlisasi media dilakukan pada suhu 121 C selama
15 menit jika media di tambah bahan tambahan yang sejenis dengan skim milk, maka sterilisasi dilakukan selama 10 menit pada suhu 110
o
C. Media yang sudah streril dicampur dan dituang ke dalam petri steril, dan didiamkan sempai memadat Kalaiarasi dan Sunitha 2009.
Kemampuan bakteri terhadap aktivitas proteolitik secara kualitatif diuji dengan menumbuhkan satu loopfull isolat bakteri pada permukaan media selektif, setelah ditumbuhkan
pada media selektif lalu diinkubasikan pada suhu ruang selama 24 sampai 48 jam, aktivitas mikroba dalam mendegradasi protein ditunjukkan dengan adanya zona halo lingkaran jernih di
sekitar koloni. Isolat dengan nilai indeks proteolitik tertinggi dilanjutkan dengan uji aktivitas enzim proteaseProduksi enzim dari bakteri terpilih dapat dilihat menggunakan starter hasil
inokulasi bakteri terpilih dalam media Nutrient Broth NB dan telah diinkubasi pada shaker incubator dengan kecepatan 100 rpm selama 24 jam. Starter yang telah berumur 24 jamtersebut
di ukur nilai Optical density OD pada = 660 nm, sampai didapatkan Optical density OD
sebesar 0,5.Sebanyak 1 starter diinokulasikanke dalam 20 ml media produksi media susu skim dan media Bussnell Hass. Kultur diinkubasi pada shaker incubator dengan kecepatan 130 rpm
pada suhu kamar selama 3 hari, dan dilakukan pengambilan sampel kultur setiap 4 jam sekali. Pada setiap pengambilan kultur setelah 4 jam sekali, kultur tersebut disentrifugasi pada
kecepatan 9.000 rpm selama 15 menit yang digunakan untuk memisahkan filtrat atau supernatant dari biomassa sel. Supernatan yang diperoleh diukur aktivitas proteolitiknya Putri et al 2012.
Menurut Muthulakshmiet al 2011, mikrorganisme produsen protease seperti bakteri asam laktat akan tumbuh baik pada suhu antara 30
o
C sampai 40
o
C. Pada suhu dibawah 30
o
C pertumbuhan bakteri pembusuk lebih tinggi dibandingkan bakteri asam laktat.
2.5. FERMENTASI PADAT
