fumigatus . Skala pengukuran menggunakan skala ordinal yaitu positif
atau negatif.
3.8 Alat dan Bahan
Bahan penelitian adalah sputum pagi hari penderita batuk kronis yang datang ke poliklinik Penyakit Paru Rumah Sakit Haji Adam Malik Kota Medan,
Alat dan bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah :
Alat penelitian:
• Cawan plastik penampung sputum • Incubator
• vortex • alat-alat gelas laboratorium seperti beaker glass dan sebagainya
• pipet tetes dan mikropipet • mikrocentrifuge
• spektrofotometer • tabung eppendorf
• alat PCR • freezer
• Gel-Doc instrument
Bahan penelitian:
• Aquabidest • Kit Isolasi DNA Promega
• Cell Lysis Solution
Universitas Sumatera Utara
• Nuclei Lysis Solution • Protein Precipitation Cell
• DNA Rehydration Solution • Isopropanol
• Ethanol 70 • 50-150 ng DNA template
• 0.5 U Taq DNA Polymerase • 6.25 nmol deoxynucleosida triphosphat
• 10 pmol primer • 2 agarose gel
• Ethidium bromide • Primer :
Primer DNA sequence 5’-3’
Location AFU5S
AFU5AS AFU7S
AFU7AS AGG GCC AGC GAG TAC ATC ACC TTG
GG G AGGT CGT TGC CAA CCTC CTCC TGA CGG CCC TTA AAT AGC CCG
GA CCG GGT TTG ACC AAC TTT 1436-1459
1648-1771 1296-1313
1681-1700
3.9 Prosedur Penelitian 3.9.1 Pengambilan sampel
Capital Health, 2011, Beattie, 2005, MDH, 2004 Sputum diambil pada pagi hari sebelum makan dan minum. Bila
menggunakan gigi palsu maka terlebih dahulu gigi palsunya dilepaskan. Gosok gigi menggunakan air tanpa pasta gigi dan berkumur dengan air
Universitas Sumatera Utara
tanpa menggunakan mouthwash. Tarik nafas dalam dan keluarkan dari hidung sebanyak 3 kali. Tarik nafas dalam dan tahan ± 5 detik, kemudian
buang secara perlahan. Tarik nafas dalam lagi dan batukkan dengan kuat hingga sputum keluar. Batukkan sputum dengan kuat dan dalam atau dapat
dibantu dengan menepuk dada sebelum di batukkan agar sputum lepas dari paru. Sputum dimasukkan ke dalam tempat yang steril. Sputum yang baik
tidak bercampur dengan air liur atau post nasal drainage. Sputum dikumpulkan hingga ± 5 ml atau sekitar 1 sendok teh. jika tidak bisa
membatukkan sputum, dapat dibantu dengan menghirup uap panas dari air yang dimasak.
3.9.2 Isolasi Sampel
Sekitar 2-4 ml sputum sampel di masukkan diletakkan di dalam tempat yang steril. Spesimen yang tidak langsung dikerjakan disimpan di lemari
es 4°C.
3.9.3 Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan bahan yang berasal dari pabrik Promega. 900µl Cell Lysis Solution dimasukkan kedalam tabung
1,5 ml dan ditambahkan 300µl sampel sputum. Tabung dibalikkan 5-6 kali agar larutan tercampur. Tabung diinkubasi selama 10 menit pada
temperatur ruangan selama inkubasi balikkan tabung 2-3 kali lalu di sentrifugasi dengan kecepatan 13.000-16.000 rpm selama 20 detik pada
temperatur ruangan. Supernatannya dibuang, dan divortex selama 10 – 15
Universitas Sumatera Utara
detik. Setelah itu, kedalam tabung ditambahkan 300µl Nuclei Lysis Solution
, dan larutannya di pipet 5-6 kali untuk memecahkan dinding jamur. Kemudian ditambahkan 100µl Protein Precipitation Solution, dan
divortex selama 10-20 detik. Supernatannya dipindahkan ke tabung 1,5ml steril yang baru, yang sebelumnya telah diisi dengan isopropanol 300µ l.
Tabung disentrifuge dengan kecepatan 13.000-16.000 rpm selama 3 menit pada temperatur ruangan. Larutannya diaduk dengan membalikkan tabung
hingga terlihat benang-benang putih halus DNA. Tabung disentrifuge dengan kecepatan 13.000-16.000 rpm selama 3 menit pada temperatur
ruangan, hingga terlihat pellet pada dasar tabung. Supernatannya dibuang, dan ditambahkan 300µl ethanol 70. Tabung di balik agar pellet dan
larutan tercampur lalu disentrifuse dengan kecepatan 13.000-16.000 rpm selama 3 menit pada temperatur ruangan. Secara perlahan ethanol dibuang
dengan pippet. Tabung dibalikkan diatas kertas absorben dan pellet dikeringkan selama 10-15 menit. Tterakhir ditambahkan 50µl DNA
Rehydration Solution kedalam tabung. DNA disimpan selama semalam
pada suhu 4 ᵒC. Lalu DNA disimpan pada suhu 2-8°C. Konsetrasi DNA
dibaca dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 260 dan 280nm.
3.9.4 Polymerase Chain Reaction PCR
PCR dilakukan dua tahap dengan menggunakan dua pasang primer yang berbeda, karena fragmen yang diharapkan cukup pendek. Tahapan PCR
Universitas Sumatera Utara
pertama dimaksudkan untuk meningkatkan jumlah DNA cetakan pada PCR tahap kedua.
Proses PCR tahap pertama menggunakan pasangan primer AFU7S dan AFU7AS mengamplifikasi region 18S rRNA. Dengan ukuran fragmen 405
bp, dan target PCR kedua dengan menggunakan pasangan primer AFU5S dan AFU5AS yang akan menghasilkan produk DNA dengan ukuran
fragmen internal 236 bp
.Gambar 3.2 Lokasi pasangan primer AFU5S-AFU5AS 236 bp dan AFU7S-AFU7AS 405 bp yang di hasilkan menggunakan PCR dua tahap
dalam mendeteksi DNA Aspergillus fumigatus. Bansod, 2008
Setiap 25 µl campuran PCR, sekitar 50 – 150 ng total DNA digunakan sebagai template. Campuran standar PCR terdiri dari 0.5 U Taq DNA
Polymerase, 6.25 nmol deoxynucleosida triphosphat, 10 pmol primer langkah pertama menggunakan primer AFU7S-AFU7AS, langkah kedua
menggunakan primer AFU5S-AFU5AS. PCR menggunakan metode Thermal Cycler Perkin-Elmer Catus, dengan urutan: PCR pertama,
prosesnya 2 menit pada suhu 94 ⁰C kemudian dilakukan sebanyak 35 siklus
selama 40 detik pada suhu 94 ⁰C, 1 menit pada 60⁰C, dan 1 menit pada
72 ⁰C, dengan langkah terakhir 5 menit pada 72⁰C dan kemudian hasilnya
Universitas Sumatera Utara
disimpan pada suhu 4 ⁰C. PCR kedua, dengan menggunakan produk hasil
dari PCR pertama sebanyak 10 µl. Prosesnya 2 menit pada suhu 94 ⁰C dan
kemudian 45 siklus selama 40 detik pada suhu 94 ⁰C, 1 menit pada suhu
60 ⁰C, dan 1 menit pada suhu 72⁰C, dan langkah terakhir 5 menit pada
72 ⁰C dan kemudian hasilnya disimpan pada suhu 4⁰C.
3.9.5 Elektroforesis
Hasil PCR di pisahkan dengan menggunakan 2 agarose gel electrophoresis, diwarnai dengan ethidium bromide. Gel dimasak dan
didinginkan pada suhu 50-60 ⁰C. setelah penambahan ethidium bromide
dengan konsentrasi 0.5 µgml, gel dibiarkan mengeras lebih kurang selama 15 menit. Kemudian di letakkan pada tank electrophoresis dengan 1x TAE
buffer. Electrophoresis dijalankan pada tegangan 70V selama 1 jam. SÖyler, 2004
3.9.6 Visualisasi DNA
DNA hasil amplifikasi yang telah dielektroforesis divisualisasi dengan menggunakan Gel Documentation. Pita DNA akan terlihat dan dapat
diketahui ukurannya berdasarkan penanda ukuran molekul yang dinyatakan dengan base pair.
Interpretasi hasil : • Negatif : Tidak terbentuk band atau terbentuk pita berukuran diatas
atau dibawah 236 bp
•
Positif : Terbentuk pita berukuran 236 bp.
Universitas Sumatera Utara
3.9.7 Kultur Sampel
Brooks, 2004, Olds, 1975 Alat dan Bahan :
• Tabung Reaksi • Sengkelit
• Mikropippet • Inkubator
• Mikroskop • Deck glass
• Sabauroud Dextrose Agar • Larutan Lactophenol cotton-blue
Koloni jamur dipelajari dengan mengamati pertumbuhannya pada media miring Sabouraud dextrose agar. Ambil 10µl sputum dengan
menggunakan sengkelit. Arsir pada pemukaaan media miring Sabouroud dextrose agar. Eramkan pada suhu kamar 26°C - 28°C selama 10 hari.
Interpretasi hasil koloni Aspergillus fumigatus jika pada permukaan media dijumpai pertumbuhan filament putih yang kemudian memproduksi spora
seperti beledru dengan warna putih keabu-abuan.
Mikroskopis: Rendam inokulum mounting dalam larutan Lactophenol cotton-blue lalu
ditutup dengan sebuah gelas penutup deck glass. Periksa dibawah mikroskop pembesaran 10.
Interpretasi hasil : Positif Jamur Aspergillus fumigatus bila dijumpai hifa bersepta konidiopora dan membentuk konidia spora.
Universitas Sumatera Utara
3.10 Tekhnik Analisa Data
Untuk menganalisa data hasil yang diperoleh ditampilkan dalam bentuk tabel frekuensi.
3.11 Kerangka Kerja
Gambar 3.3 Kerangka Kerja Penelitian Pengumpulan Sputum Penderita Batuk Kronis
Isolasi Sampel
Isolasi DNA
PCR
Elektroforesis
Visualisasi
Hasil - Hasil +
Kultur Sampel
Mikroskopik
Terdapat pita berukuran 236bp
Tidak ada pita
Terdapat pita yang bukan
berukuran 236bp Terdapat
konidiasporaspora Aspergillus fumigatus
Tidak Terdapat konidiasporaspora
Aspergillus fumigatus
Hasil + Hasil -
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL PENELITIAN
4.1 Hasil Penelitian
Pengumpulan sampel dilakukan di poli paru Rumah Sakit Haji Adam Malik Medan. Jumlah keseluruhan sampel sebanyak 51 orang penderita batuk
kronis. Data sampel penelitian dilakukan analisis seperti diuraikan di bawah ini.
4.1.1 Karakteristik Subjek Penelitian
Subjek penelitian berjumlah 51 orang dan didapatkan pasien laki – laki 29 orang 57 dan sisanya perempuan 22 orang 43. Pada penelitian ini pasien
yang paling muda berumur 17 tahun sedangkan yang paling tua beumur 70 tahun.
4.1.2 Hasil Pemeriksaan Sputum Menggunakan Tekhnik PCR
Dari hasil pemeriksaan sputum menggunakan tekhnik PCR, didapatkan bahwa penderita batuk kronis yang datang berobat ke poli paru Rumah Sakit Haji
Adam Malik Medan ternyata sebagian sputumnya mengandung DNA jamur Aspergillus fumigatus
tabel 4.1. Tabel 4.1 Distribusi Hasil PCR pada pemeriksaan sputum
Hasil PCR Jumlah orang
Persentase Positif
35 68,62
Negatif 16
31,37 Jumlah
51 100
Universitas Sumatera Utara