Isolasi Sampel Isolasi DNA Polymerase Chain Reaction PCR

tanpa menggunakan mouthwash. Tarik nafas dalam dan keluarkan dari hidung sebanyak 3 kali. Tarik nafas dalam dan tahan ± 5 detik, kemudian buang secara perlahan. Tarik nafas dalam lagi dan batukkan dengan kuat hingga sputum keluar. Batukkan sputum dengan kuat dan dalam atau dapat dibantu dengan menepuk dada sebelum di batukkan agar sputum lepas dari paru. Sputum dimasukkan ke dalam tempat yang steril. Sputum yang baik tidak bercampur dengan air liur atau post nasal drainage. Sputum dikumpulkan hingga ± 5 ml atau sekitar 1 sendok teh. jika tidak bisa membatukkan sputum, dapat dibantu dengan menghirup uap panas dari air yang dimasak.

3.9.2 Isolasi Sampel

Sekitar 2-4 ml sputum sampel di masukkan diletakkan di dalam tempat yang steril. Spesimen yang tidak langsung dikerjakan disimpan di lemari es 4°C.

3.9.3 Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan bahan yang berasal dari pabrik Promega. 900µl Cell Lysis Solution dimasukkan kedalam tabung 1,5 ml dan ditambahkan 300µl sampel sputum. Tabung dibalikkan 5-6 kali agar larutan tercampur. Tabung diinkubasi selama 10 menit pada temperatur ruangan selama inkubasi balikkan tabung 2-3 kali lalu di sentrifugasi dengan kecepatan 13.000-16.000 rpm selama 20 detik pada temperatur ruangan. Supernatannya dibuang, dan divortex selama 10 – 15 Universitas Sumatera Utara detik. Setelah itu, kedalam tabung ditambahkan 300µl Nuclei Lysis Solution , dan larutannya di pipet 5-6 kali untuk memecahkan dinding jamur. Kemudian ditambahkan 100µl Protein Precipitation Solution, dan divortex selama 10-20 detik. Supernatannya dipindahkan ke tabung 1,5ml steril yang baru, yang sebelumnya telah diisi dengan isopropanol 300µ l. Tabung disentrifuge dengan kecepatan 13.000-16.000 rpm selama 3 menit pada temperatur ruangan. Larutannya diaduk dengan membalikkan tabung hingga terlihat benang-benang putih halus DNA. Tabung disentrifuge dengan kecepatan 13.000-16.000 rpm selama 3 menit pada temperatur ruangan, hingga terlihat pellet pada dasar tabung. Supernatannya dibuang, dan ditambahkan 300µl ethanol 70. Tabung di balik agar pellet dan larutan tercampur lalu disentrifuse dengan kecepatan 13.000-16.000 rpm selama 3 menit pada temperatur ruangan. Secara perlahan ethanol dibuang dengan pippet. Tabung dibalikkan diatas kertas absorben dan pellet dikeringkan selama 10-15 menit. Tterakhir ditambahkan 50µl DNA Rehydration Solution kedalam tabung. DNA disimpan selama semalam pada suhu 4 ᵒC. Lalu DNA disimpan pada suhu 2-8°C. Konsetrasi DNA dibaca dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 260 dan 280nm.

3.9.4 Polymerase Chain Reaction PCR

PCR dilakukan dua tahap dengan menggunakan dua pasang primer yang berbeda, karena fragmen yang diharapkan cukup pendek. Tahapan PCR Universitas Sumatera Utara pertama dimaksudkan untuk meningkatkan jumlah DNA cetakan pada PCR tahap kedua. Proses PCR tahap pertama menggunakan pasangan primer AFU7S dan AFU7AS mengamplifikasi region 18S rRNA. Dengan ukuran fragmen 405 bp, dan target PCR kedua dengan menggunakan pasangan primer AFU5S dan AFU5AS yang akan menghasilkan produk DNA dengan ukuran fragmen internal 236 bp .Gambar 3.2 Lokasi pasangan primer AFU5S-AFU5AS 236 bp dan AFU7S-AFU7AS 405 bp yang di hasilkan menggunakan PCR dua tahap dalam mendeteksi DNA Aspergillus fumigatus. Bansod, 2008 Setiap 25 µl campuran PCR, sekitar 50 – 150 ng total DNA digunakan sebagai template. Campuran standar PCR terdiri dari 0.5 U Taq DNA Polymerase, 6.25 nmol deoxynucleosida triphosphat, 10 pmol primer langkah pertama menggunakan primer AFU7S-AFU7AS, langkah kedua menggunakan primer AFU5S-AFU5AS. PCR menggunakan metode Thermal Cycler Perkin-Elmer Catus, dengan urutan: PCR pertama, prosesnya 2 menit pada suhu 94 ⁰C kemudian dilakukan sebanyak 35 siklus selama 40 detik pada suhu 94 ⁰C, 1 menit pada 60⁰C, dan 1 menit pada 72 ⁰C, dengan langkah terakhir 5 menit pada 72⁰C dan kemudian hasilnya Universitas Sumatera Utara disimpan pada suhu 4 ⁰C. PCR kedua, dengan menggunakan produk hasil dari PCR pertama sebanyak 10 µl. Prosesnya 2 menit pada suhu 94 ⁰C dan kemudian 45 siklus selama 40 detik pada suhu 94 ⁰C, 1 menit pada suhu 60 ⁰C, dan 1 menit pada suhu 72⁰C, dan langkah terakhir 5 menit pada 72 ⁰C dan kemudian hasilnya disimpan pada suhu 4⁰C.

3.9.5 Elektroforesis