Sterilisasi Alat Pembuatan Fraksi Kloroform Daun Sirsak Annona muricata L. Pembuatan Stok Kultur Bakteri Penyiapan Inokulum Bakteri Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Metanol dan Kloroform Dengan Berbagai Konsentrasi

3.8 Sterilisasi Alat

Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di dalam oven pada suhu 170°C selama 1 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Jarum ose dan pinset dipijar dengan lampu Bunsen Lay, 1994.

3.9 Pembuatan Fraksi Kloroform Daun Sirsak Annona muricata L.

Sebanyak 10 g ekstrak metanol ditambahkan 10 ml pelarut metanol sambil diaduk sampai homogen, dipindahkan ke dalam corong pisah dan ditambahkan akuades sebanyak 20 ml dan n-heksana 40 ml, dikocok dan dibiarkan sampai memisah, selanjutnya difraksinasi dengan pelarut n-heksan beberapa kali hingga diperoleh fraksi n-heksana yang jernih, kemudian fraksi metanol sisa ditambahkan pelarut kloroform 40 ml, dan dilakukan pemisahan sesuai prosedur fraksinasi diatas sampai diperoleh fraksi kloroform yang jernih. Hasil fraksinasi kloroform diuapkan diatas penangas air hingga diperoleh ekstrak kering fraksi kloroform.

3.10 Pembuatan Stok Kultur Bakteri

Koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanam pada media nutrient agar miring dengan cara menggores. Kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 36-37°C selama 18-24 jam Ditjen POM, 1995. Universitas Sumatera Utara

3.11 Penyiapan Inokulum Bakteri

Koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril lalu disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml media nutrient broth. Kemudian diukur kekeruhan larutan pada panjang gelombang 580 nm sampai diperoleh transmitan 25 yang setara dengan 10 6 CFU Colony Forming UnitsDitjen POM, 1995.

3.12 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Metanol dan Kloroform Dengan Berbagai Konsentrasi

Ekstrak metanol ditimbang 3 g dilarutkan dengan dimetil sulfoksida DMSO hingga 10 ml maka konsentrasi ekstrak adalah 300 mgml kemudian dibuat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh ekstrak dengan konsentrasi 250 mgml; 200 mgml; 150 mgml; 100 mgml; 50 mgml; 25 mgml; 10 mgml; 5 mgml. Dilakukan prosedur yang sama terhadap fraksi kloroform dengan pelarut dimetil sulfoksida DMSO.

3.13 Metode Pengujian Efek Antibakteri Secara In Vitro