BAB III METODE PENELITIAN
Metode yang digunakan adalah metode eksperimental parametrik meliputi pengumpulan dan pengolahan bahan tumbuhan, skrining fitokimia,
pembuatan ekstrak dan fraksinasi ekstrak. Selanjutnya pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar menggunakan cakram kertas. Parameter
yang dilihat adalah besarnya diameter hambat pertumbuhan bakteri. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fitokimia dan Laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas, autoklaf Fisons, blender Philips, bola karet,cakram kertas diameter 6 mm,
freeze dryerModulio, inkubator Fiber Scientific, jangka sorong, jarum ose, kamera digital Samsung, kertas saring, kompor gas Sharp, Laminar Air
Flow CabinetAstec HLF 1200L, lemari pendingin Toshiba, oven Memmert, penangas air,pinset, pipet mikro Eppendorf,rotary evaporator
Haake D, spektrofotometer visible Dynamic, timbangan digital Mettler Toledo.
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan-Bahan
Bahan- bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirsak, nutrient agar,nutrient broth, bakteriStaphylococcus aureus ATCC No. 6538
dan Escherichia coli ATCC No. 25922, akuades, bahan kimia yang digunakan berkualitas pro analisa, kecuali dinyatakan lain: alfa-naftol, amil
alkohol, asam asetat anhidrida, asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida, bismut III nitrat, dimetil sulfoksida
DMSO, etanol, etil asetat, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloroform,kristal natrium hidroksida, metanol destilasi, n-heksana, natrium
klorida, raksa II klorida, timbal II asetat, serbuk magnesium.
3.3 Pengumpulan Dan Pengolahan Bahan Tumbuhan 3.3.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan
Pengumpulan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif. Daun sirsak yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari pohon sirsak yang berada di
Kelurahan Tanjung Mulia, Kecamatan Medan Deli, Kota Medan, Provinsi Sumatera Utara sekitar bulan Januari tahun 2013. Daun yang digunakan adalah
daun ke 4 sampai 5 dari pucuk.
3.3.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan daun sirsak dilakukan di Herbarium Medanense, Universitas Sumatera Utara.
Universitas Sumatera Utara
3.3.3 Pembuatan Simplisia
Daun sirsak yang telah dikumpulkan disortasi basah yaitu memisahkan daun sirsak dari bagian lain tumbuhan daun sirsak yang terikut, kotoran-
kotoran atau bahan asing lainnya, kemudian daun sirsak yang telah terkumpul ditimbang, lalu dicuci untuk menghilangkan debu yang melekat. Pencucian
dilakukan dengan air keran yang mengalir, ditiriskan, dikeringkan dengan cara diangin-anginkan diudara terbuka terlindung dari sinar matahari langsung.
Proses pengeringan dilakukan sampai daun sirsak mudah diremukkan. Simplisia yang telah kering disortasi kering yaitu memisahkan benda asing
seperti pengotoran-pengotoran lain yang terjadi selama pengeringan, kemudian ditimbang kembali. Simplisia selanjutnya diserbuk dengan menggunakan
blender. Serbuk simplisia dimasukkan ke dalam kantung plastik dan disimpan ditempat yang terlindung dari sinar matahari. Gambar simplisia daun sirsak dan
serbuk daun sirsak dapat dilihat pada Lampiran 3, halaman 45.
3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi
Pembuatan larutan pereaksi menurut Depkes 1995, asam klorida 2 N, asam nitrat 0,5 N, asam sulfat 2 N, besi III klorida 1, Bouchardat,
Dragendorff, Mayer, Molish, natrium hidroksida 2 N, timbal II asetat 0,4 M. Liebermann-Burchard menurut Farnsworth 1966.
3.4.1 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 16,67 ml asam klorida pekat dilarutkan dalam air suling hingga volume 100 ml.
Universitas Sumatera Utara
3.4.2 Pereaksi asam nitrat 0,5 N
Sebanyak 3,4 ml asam nitrat pekat diencerkan dengan air suling hingga volume 100 ml.
3.4.3 Pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 5,4 ml asam sulfat pekat dilarutkan dalam air suling hingga volume 100 ml.
3.4.4 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml.
3.4.5 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida, dilarutkan dalam sedikit air suling kemudian ditambahkan 2 g iodium, setelah semuanya larut ditambahkan air
suling hingga 100 ml.
3.4.6 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 g bismut III nitrat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat. Pada wadah lain dilarutkan 27,2 g kalium iodida lalu
dilarutkan dalam 50 ml air suling. Kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan
diencerkan dengan air suling hingga 100 ml.
3.4.7 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,35 g raksa II klorida dilarutkan dalam 60 ml air suling. Kemudian pada wadah lain sebanyak 5 g kalium iodida dilarutkan dalam 10 ml
air lalu campurkan keduanya dan ditambahkan air suling hingga 100 ml.
Universitas Sumatera Utara
3.4.8 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g alfa-naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga volume 100 ml
3.4.9 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml.
3.4.10 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,77 g timbal II asetat dilarutkan dalam air bebas karbondioksida hingga 100 ml.
3.4.11 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 5 ml asam asetat anhidrida dicampurkan dengan 5 ml asam sulfat pekat kemudian ditambahkan etanol hingga 50 ml.
3.5 Skrining Fitokimia 3.5.1 Pemeriksaan alkaloida
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan
disaring. Filtrat dipakai untuk uji alkaloida sebagai berikut: a.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer akan terbentuk endapan berwarna putih atau kuning.
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi
Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman.
Universitas Sumatera Utara
c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi
Dragendorff, akan terbentuk endapan merah atau jingga. Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua
dari tiga percobaan Depkes, 1980.
3.5.2 Pemeriksaan antrakinon
Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditambah 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen, dikocok dan
didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring. Lapisan benzen dikocok dengan 2 ml natrium hidroksida 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah
dan lapisan benzen tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon Depkes, 1980.
3.5.3 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan
diambil 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin
Depkes, 1980.
3.5.4. Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, kedalam 5 ml filtrat
ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi
warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1996.
Universitas Sumatera Utara
3.5.5 Pemeriksaan glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 96 dengan air 7:3 direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring.
Kemudian diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat disari
dengan 20 ml campuran kloroform dan isopropanol 3:2, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Kumpulan sari air diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50°C.
Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan:
Sebanyak 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi dan diuapkan diatas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes
pereaksi Molish. Kemudian secara perlahan-lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuk cincin warna ungu pada batas
antara kedua cairan menunjukkanadanya ikatan gula Depkes, 1980.
3.5.6 Pemeriksaan steroidatriterpenoida
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksana selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada sisanya
ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Liebermann-Burchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah
yang berubah menjadi biru hijau menunjukkan adanya steroidatriterpenoida Harborne, 1987.
Universitas Sumatera Utara
3.5.7 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan dan kemudian dikocok kuat-kuat
selama 10 detik. Jika terbentuk buih yang mantap selama tidak kurang dari 10 menit, setinggi 1 cm-10 cm dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam
klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes, 1980.
3.6 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut metanol. Sebanyak 500 g serbuk simplisia daun sirsak dimaserasi
dengan pelarut metanolsampai seluruh serbuk terendam, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil sesekali diaduk. Setelah 5 hari
campuran tersebut disaring, kemudian ampasnya dicuci dengan metanol, filtrat dimasukkan dalam bejana dan disimpan di tempat yang terlindung dari cahaya
selama 2 hari, kemudian dienap tuangkan Ditjen POM, 1979. Seluruh maserat digabung dan dipekatkan dengan bantuan alat rotary evaporator pada
temperatur tidak lebih 40°C sampai diperoleh ekstrak kental kemudian dikeringkan dengan freeze dryer. Bagan pembuatan ekstrak dan fraksinasi
serbuk simplisia dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 46.
Universitas Sumatera Utara
3.7 Pembuatan Media 3.7.1 Media nutrient agar
Kategori