18
2. Pembuatan Koloidal Kitosan Arnold dan Solomon, 1986
Tepung kitosan dicampurkan dengan HCl pekat dengan perbandingan 1:20 lalu didiamkan selama semalam di cool room. Larutan
tersebut difiltrasi dengan glass wool lalu ditambahkan air dingin sebanyak 10 kali berat tepung kitosan. Filtrat yang diperoleh kemudian dinetralkan
pH-nya dengan larutan NaOH 12 N. Larutan tersebut disaring di cool room
lalu dibilas dengan 50 ml air dingin. Koloidal kitosan yang diperoleh disimpan pada suhu dingin.
3. Penyegaran Kultur
Penyegaran kultur dilakukan dengan mengambil 1-2 ose isolat Bacillus licheniformis
MB-2 dari kultur persediaan gliserol lalu digoreskan pada media thermus padat dan diinkubasi pada inkubator suhu 55
C selama 5 hari. Aktivitas enzim kitosanase ditandai dengan adanya areal
bening di sekitar koloni bakteri. Media thermus padat yang digunakan adalah 1.0 koloidal kitosan, 0.7 K
2
HPO
4
, 0.3 KH
2
PO
4
, 0.5 MgSO
4
, 0.25 ekstrak khamir, 0.25 casiton, 1.5 bacto agar, dan 0.4 gelrite
pH 6 Chasanah, 2004.
4. Pembuatan Kultur Starter
Pembuatan kultur starter dilakukan dengan menginokulasikan 1-2 ose koloni bakteri yang menunjukkan aktivitas enzim kitosanase ke dalam
150 ml media thermus cair lalu diinkubasi pada shaker waterbath suhu 55
C selama 24 jam dengan kecepatan agitasi 120 rpm. Media thermus cair yang digunakan berdasarkan pada Park et al. 1999, yaitu 0.4
koloidal kitosan, 0.7 K
2
HPO
4
, 0.3 KH
2
PO
4
, 0.5 MgSO
4
, 0.25 ekstrak khamir, dan 0.25 casiton pH 7.
5. Produksi Enzim Kitosanase Chasanah, 2004
Kultur starter sebanyak 15 ml dimasukkan ke dalam 85 media thermus
cair lalu diinkubasi pada shaker waterbath suhu 55 C selama 7
hari dengan kecepatan 120 rpm. Media yang digunakan untuk produksi
19 enzim kitosanase sama dengan media yang digunakan untuk pembuatan
kultur starter. Setelah ditumbuhkan dalam media thermus cair selama 7 hari, sel
bakteri dan sisa-sisa media yang tidak larut dipisahkan dengan cara sentifugasi pada 4
C selama 20 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan bebas sel yang diperoleh kemudian ditambah ammonium sulfat
pada tingkat kejenuhan 80. Penambahan ammonium sulfat dilakukan secara perlahan-lahan pada suhu dingin sambil di-stirrer. Setelah itu,
supernatan disimpan selama semalam di cool room. Endapan yang berisi enzim dan beberapa jenis protein lainnya dipisahkan dengan cara
sentrifugasi pada 4 C selama 20 menit dengan kecepatan 10000 rpm.
Endapan tersebut kemudian dilarutkan dalam 0.05 M buffer fosfat pH 6 untuk menjadikan volume larutan sebanyak 8 ml. Larutan enzim yang
diperoleh disebut enzim kasar crude enzyme.
6. Dialisis
Kategori