20 Enzim yang telah beku kemudian dimasukkan ke dalam tabung dan siap
untuk di-freeze dry. Freeze dry dilakukan sampai volume larutan enzim yang tersisa ±
2 3
dari volume larutan enzim mula-mula ± 2 ml.
8. Pemurnian Enzim Kitosanase Haliza, 2003
Pemurnian enzim kitosanase dilakukan pada suhu dingin. Enzim hasil freeze dry digunakan untuk pemurnian. Enzim ini dimurnikan dengan
menggunakan kromatografi filtrasi gel. Matriks yang digunakan untuk kromatografi filtrasi gel adalah Sephadex G-100. Matriks ini terlebih
dahulu harus dikembangkan swelling sebelum digunakan. Swelling dilakukan dengan merendam Sephadex G-100 dalam akuades pada suhu
dingin selama 3 hari. Setelah itu, gel tersebut divakum dengan menggunakan Millipore untuk menghilangkan gelembung-gelembung
udara yang dapat mengganggu pemurnian. Kolom yang akan digunakan untuk pemurnian harus dibilas terlebih dahulu menggunakan akuades dan
air bebas ion. Matriks dimasukkan secara perlahan ke dalam kolom sambil disetimbangkan dengan 0.05 M buffer fosfat pH 6. Matriks tersebut
dibiarkan memadat selama semalam. Enzim hasil freeze dry sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam kolom. Elusi dilakukan dengan buffer yang sama.
Fraksi dikumpulkan dengan menggunakan fraction collector setiap 100 drop
. Setiap fraksi yang ditampung diukur aktivitas enzim kitosanase dan konsentrasi protein.
9. Elektroforesis SDS-PAGE Edelstein dan Bollag, 1991
Persiapan awal yang perlu dilakukan dalam elektroforesis adalah pembuatan gel. Metode yang digunakan dalam pembuatan gel adalah
metode Edelstein dan Bollag 1991. Komposisi gel SDS-PAGE dapat dilihat pada tabel 2.
Tabel 2 . Komposisi gel SDS-PAGE
Bahan Separating gel
8 Stacking gel
4 Larutan A
Larutan B 2.7 ml
2.5 ml 0.67 ml
-
21 Larutan C
Akuabides APS 10
TEMED -
4.8 ml 50 µl
5.0 µl 1.25 ml
3.0 ml 50 µl
5.0 µl Bahan untuk separating gel dicampur satu persatu dengan
memasukkan TEMED pada akhir campuran. Larutan tersebut diaduk dan dipipet perlahan ke dalam plate kaca sampai 1.5 cm dari permukaan kaca
lalu didiamkan sekitar 15-20 menit. Dalam proses ini diusahakan agar tidak terbentuk gelembung udara. Setelah gel memadat, campuran stacking
gel dipipet perlahan ke dalam plate kaca lalu dengan segera dimasukkan
sisir 10 sumur sebagai tempat memasukkan sampel. Sampel yang telah dipanaskan pada 100
C selama 3 menit dicampurkan dengan buffer sampel lalu dilakukan loading sampel ke
dalam sumur sebanyak 12 µl. Berbeda halnya dengan sampel, Marker yang di-loading ke dalam sumur sebanyak 10 µl. Sebelum running
dilakukan, buffer elektroforesis dimasukkan ke dalam chamber. Running elektroforesis dilakukan pada 100 Volt, 50 mA dalam kondisi dingin.
Waktu yang diperlukan untuk running elektroforesis sekitar 1.5 jam. Setelah pemisahan, gel dilepas dari plate kaca lalu direndam dalam
larutan fiksasi 25 metanol + 12 asam asetat selama 1 jam. Selanjutnya, gel tersebut direndam dalam larutan etanol 50 selama 20
menit dan larutan etanol 30 selama 2 x 20 menit. Setelah itu, gel tersebut direndam dalam larutan enhancer larutan Na
2
S
2
O
3
.5H
2
O selama 1 menit. Gel kemudian dicuci dengan akuabides selama 3 x 20 menit. Setelah
dicuci dengan akuabides, gel direndam dalam larutan staining silver nitrat larutan AgNO
3
+ formaldehida 37 selama 30 menit lalu dibilas cepat dengan akuabides selama 2 x 20 detik. Kelebihan warna dihilangkan
dengan larutan destaining larutan Na
2
CO
3
+ formaldehida 37 sampai diperoleh pita-pita protein yang jelas teramati dengan latar belakang relatif
jernih. Reaksi dihentikan dengan menggunakan larutan fiksasi.
22
10. Karakterisasi Enzim Kitosanase Chasanah, 2004
