29 akan melewatkan zat terlarut dengan berat molekul di bawah 10000 Dalton
Morris dan Morris, 1976. Buffer yang digunakan di luar kantung memiliki konsentrasi lebih rendah daripada konsentrasi buffer yang ada di dalam
kantung. Molekul berukuran kecil seperti garam ataupun ion pengganggu lainnya akan melewati pori-pori membran sampai konsentrasi di dalam dan di
luar kantung mencapai nilai yang sama dan larutan buffer masuk ke dalam kantung menggantikan molekul kecil yang keluar Boyer, 1986.
Menurut Harris dan Angal 1989, untuk menghindari kontaminasi dari bahan kimia, maka kantung dialisis terlebih dahulu direbus selama 10 menit
dalam NaHCO
3
dan EDTA lalu dicuci dan direbus kembali dengan air bebas ion selama 10 menit sebanyak 2 kali. Dialisis dilakukan di cool room untuk
mengurangi terjadinya penurunan aktivitas enzim. Pengadukan dengan kecepatan rendah bertujuan untuk mempermudah keluarnya molekul
berukuran kecil dari kantung dialisis dan mencegah molekul tersebut terkonsentrasi di sekitar kantung.
Enzim hasil dialisis menunjukkan adanya penurunan aktivitas enzim, meskipun penurunan aktivitas enzimnya sangat kecil, yaitu menjadi 1.086
Uml. Konsentrasi protein pun mengalami penurunan menjadi 0.531 mgml. Kemungkinan protein non enzim yang berukuran kecil BM 10000 ikut
keluar dari kantung dialisis sehingga larutan enzim cukup murni. Hal ini terlihat dari aktivitas spesifik pada enzim hasil dialisis meningkat
dibandingkan aktivitas spesifik pada crude enzyme, yaitu 2.045 Umg.
D. Pemurnian Enzim Kitosanase
Enzim hasil dialisis yang telah di-freeze dry digunakan untuk pemurnian. Enzim ini dimurnikan dengan kromatografi filtrasi gel. Matriks yang
digunakan adalah Sephadex G-100. Sephadex G-100 memiliki kisaran fraksinasi protein sebesar 4000-150000 yang berarti gel tersebut dapat
digunakan untuk memisahkan protein-protein yang memiliki berat molekul antara 4000-150000 Dalton Walsh, 2002. Oleh karena itu, Sephadex G-100
cukup baik digunakan karena berat molekul dari enzim kitosanase ini belum diketahui.
30 Kromatografi filtrasi gel menggunakan bahan pengisi yang merupakan gel
yang berpori-pori. Ukuran partikel gel dinyatakan dalam diameter partikel dalam kondisi kering dan Sephadex G-100 memiliki diameter sebesar 40-120
µm Walsh, 2002. Pori-pori pada permukaan gel ini cukup kecil sehingga mencegah molekul-molekul yang besar masuk ke dalamnya, tetapi dapat
menampung molekul-molekul yang lebih kecil. Selain untuk pemurnian enzim, kromatografi filtasi gel dapat juga digunakan untuk penghilangan
garam desalting Suhartono et al., 1992.
0.2 0.4
0.6 0.8
1 1.2
10 20
30 40
50 60
Fraksi A
k ti
v ita
s U m
l
0.2 0.4
0.6 0.8
1 1.2
A 5
9 5
n m
A 595 nm Aktivitas Uml
Gambar 5 . Hasil pemurnian kitosanase menggunakan filtrasi gel
Pemurnian enzim dilakukan dengan memasukkan enzim hasil freeze dry ke dalam kolom dan dilakukan elusi menggunakan 0.05 M buffer fosfat pH 6.
Fraksi-fraksi hasil pemurnian ditampung masing-masing sebanyak 100 drop ± 3 ml lalu setiap fraksi diukur aktivitas enzim kitosanase dan konsentrasi
proteinnya. Hasil pemurnian enzim menggunakan kromatografi filtasi gel dapat dilihat pada gambar 5. Hasil pemurnian menunjukkan bahwa fraksi 44
memiliki aktivitas spesifik dan tingkat kemurnian yang tinggi sehingga selanjutnya dilakukan karakterisasi terhadap enzim murni tersebut. Tahapan
pemurnian enzim kitosanase dari Bacillus licheniformis MB-2 dapat dilihat pada tabel 4.
31
Tabel 4 . Tahapan pemurnian enzim kitosanase Bacillus licheniformis MB-2
TahapanHasil Aktivitas Enzim
Uml Konsentrasi
Protein mgml
Aktivitas Spesifik
Umg Tingkat
Kemurnian Supernatan bebas sel
Crude enzyme Enzim hasil dialisis
Enzim murni fraksi 44 1.076
1.087 1.086
1.089 0.237
0.759 0.531
0.008 4.539
1.433 2.045
136.125 1
0.316 0.45
29.99
E. Karakterisasi Enzim Kitosanase 1
