23 Ea
= energi aktivasi kkalgmol. K
R = tetapan gas 1.987 kalgmol.
K A
= faktor frekuensi
d. Pengaruh pH Terhadap Stabilitas Enzim
Pengujian pengaruh pH terhadap stabilitas enzim murni dilakukan dengan cara memanaskan enzim dalam buffer universal pH 6 tanpa
substrat pada 70 C selama 0, 0.5, 1, 1.5, dan 2 jam.
11. Pengukuran Aktivitas Enzim Kitosanase Yoon et al., 2000
Prinsip pengukuran aktivitas enzim kitosanase didasarkan pada perhitungan gula pereduksi yang diproduksi dalam hidrolisis soluble
chitosan dengan metode Schales modifikasi dan glukosamin digunakan
sebagai standar Imoto dan Yagashita, 1971.
Tabel 3 . Pengukuran aktivitas enzim kitosanase
Bahan Sampel µl
Kontrol µl
Blanko µl
0.05 M buffer fosfat pH 6 100
100 -
Soluble chitosan 100 100 -
Enzim kitosanase 100
- -
Inkubasi pada 70 C selama 30 menit
Freeze selama 15 menit
Campuran 200 133
- Enzim kitosanase
- 67
- Air bebas ion
800 800
1000 Pereaksi Schales 1000
1000 1000
Didihkan selama 15 menit Sentrifugasi pada 4
C selama 10 menit dengan kecepatan 8000 rpm Ukur absorbansi pada panjang gelombang 420 nm
Nilai absorbansi dari sampel, kontrol, dan blanko dimasukkan ke dalam kurva standar glukosamin sehingga dapat ditentukan jumlah
glukosamin yang terkandung di dalam sampel. Selanjutnya, jumlah glukosamin tersebut dimasukkan ke dalam rumus untuk menentukan unit
24 aktivitas enzim. Satu unit aktivitas enzim kitosanase didefinisikan sebagai
jumlah enzim yang memproduksi 1 µmol gula pereduksi glukosamin per menit pada kondisi tertentu. Aktivitas spesifik enzim ditentukan dengan
cara membagi unit aktivitas enzim dengan konsentrasi protein. Tingkat kemurnian diperoleh dengan membagi aktivitas spesifik enzim pada satu
tahap dengan aktivitas spesifik enzim pada tahap sebelumnya. Unit aktivitas enzim = 300 x Glc x 1 x 1000 x 1
.....4 Uml 200 BM 100 30
Keterangan : 300 = volume sampel hasil reaksi enzimatis µl
200 = volume sampel untuk reaksi Schales µl Glc = jumlah glukosamin sampel µgml
BM = berat molekul glukosamin, yaitu 215.6 grammol 1000 = faktor konversi dari µl ke ml
100 = volume larutan enzim atau larutan soluble chitosan µl 30
= waktu inkubasi menit
12. Pengukuran Konsentrasi Protein Bradford, 1976
Sampel protein sebanyak 100 µl ditambah dengan 2 ml Bradford reagent
. Campuran tersebut divorteks dan didiamkan pada suhu ruang selama 5 menit. Protein akan diikat oleh Coomassie Briliant Blue G-250
yang terdapat pada Bradford reagent membentuk kompleks berwarna biru. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 595 nm. Konsentrasi protein
sampel dihitung berdasarkan kurva standar BSA.
25
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Produksi Enzim Kitosanase
Semua mikroorganisme memerlukan nutrien dasar sebagai sumber karbon, nitrogen, dan faktor esensial pertumbuhan mineral dan vitamin untuk
menopang pertumbuhannya. Nutrien dasar tersebut di samping menyediakan energi juga digunakan untuk pembentukan konstituen seluler. Oleh karena itu,
untuk mendapatkan hasil yang maksimum, media pertumbuhan yang digunakan harus mengandung nutrien dasar tersebut Wang et al., 1979.
Isolat Bacillus licheniformis MB-2 disegarkan terlebih dahulu agar mencapai kondisi optimalnya. Isolat tersebut ditumbuhkan pada media
thermus padat dan diinkubasi pada inkubator suhu 55
C. Inkubasi dalam suhu ruang dilakukan selama ± 30 menit sebelum dimasukkan ke dalam inkubator
suhu 55 C agar isolat tidak mengalami thermal shock akibat perubahan suhu
drastis. Media thermus padat yang digunakan terdiri atas 1.0 koloidal kitosan, 0.7 K
2
HPO
4
, 0.3 KH
2
PO
4
, 0.5 MgSO
4
, 0.25 ekstrak khamir, 0.25 casiton, 1.5 bacto agar, dan 0.4 gelrite Chasanah, 2004. Koloidal
kitosan digunakan sebagai substrat induser untuk memproduksi enzim kitosanase. Hal ini karena sebagian besar mikroorganisme memproduksi
enzim tersebut secara induktif. K
2
HPO
4
dan KH
2
PO
4
digunakan sebagai sumber fosfor yang diperlukan dalam sintesis asam nukleat, fosfolipid, dan
ATP. MgSO
4
digunakan sebagai kofaktor enzim dan pertumbuhan. Ekstrak khamir dan casiton digunakan sebagai sumber nitrogen untuk produksi enzim
kitosanase Stanbury dan Whitaker, 1984. Isolat Bacillus licheniformis MB-2 ditumbuhkan pada waktu optimumnya,
yaitu 5 hari. Selama waktu tersebut dihasilkan enzim dengan aktivitas tertinggi. Waktu yang terlalu singkat akan menghasilkan enzim yang tidak
optimal akibat mikroba belum beradaptasi dengan lingkungannya. Waktu yang terlalu lama akan menyebabkan enzim mengalami inhibisi akibat
menumpuknya produk reaksi enzim dengan substrat. Jumlah mikroba yang semakin meningkat dari hari ke hari akan membutuhkan nutrien yang semakin
