13 asam lemah. Selain itu, Sephadex juga stabil pada kisaran pH 1-10
sehingga hal yang paling utama dalam memilih buffer adalah kestabilan molekul yang dikehendaki dalam buffer yang dipilih. Kromatografi filtrasi
gel baik dipergunakan pada tahap akhir pemurnian. Kromatografi ini memiliki kapasitas terbatas dan kecepatan fraksinasi rendah Suhartono et
al ., 1992. Sebagian besar pemurnian enzim kitosanase menggunakan
kromatografi filtrasi gel dan kromatografi pertukaran ion Haliza, 2003.
Gambar 3 . Prinsip pemisahan protein menggunakan filtrasi gel
Kromatografi interaksi hidrofobik merupakan metode pemisahan protein karena perbedaan polaritas antar molekul protein pada kekuatan
ion tertentu. Peningkatan kekuatan ionik larutan karena penambahan garam netral seperti ammonium sulfat atau sodium klorida akan
meningkatkan interaksi hidrofobik protein. Protein diikat oleh matriks yang bersifat non polar. Protein dibebaskan dari ikatan ini dengan
menggunakan eluen yang polaritasnya diturunkan Walsh, 2002.
F. Elektroforesis SDS-PAGE
Elektroforesis adalah teknik pemisahan fraksi-fraksi zat berdasarkan migrasi partikel bermuatan di bawah pengaruh medan listrik karena adanya
14 perbedaan ukuran, bentuk, muatan, atau sifat kimia molekul. Elektroforesis
dapat digunakan untuk menentukan berat molekul protein, mendeteksi kemurnian dan kerusakan protein, menetapkan titik isoelektrik protein, dan
memisahkan spesies-spesies molekuler yang berbeda secara kuantitatif dan kualitatif Boyer, 1986.
Protein memiliki gugus-gugus yang dapat terionisasi sehingga membentuk gugus bermuatan pada pH tertentu baik sebagai anion maupun kation sehingga
dapat dipisahkan dengan teknik elektoforesis. Protein akan bermuatan tergantung pada pH larutan dan titik isoelektrik. Pada titik isoelektrik, protein
tidak akan bergerak di bawah pengaruh medan listrik. Jika pH larutan di bawah pI, protein bergerak sebagai kation dan kecepatannya naik dengan
turunnya pH lalu kation ini akan bergerak ke elektroda negatif. Jika pH larutan di atas pI, protein bergerak sebagai anion dan kecepatannya naik dengan
meningkatnya pH lalu anion ini akan bergerak ke elektroda positif Edelstein dan Bollag, 1991.
Media yang digunakan untuk elektroforesis harus dapat mengurangi atau mencegah terjadinya konveksi dan tidak bereaksi dengan sampel atau
menghambat pergerakan partikel sebagai akibat adanya ikatan antara sampel dengan matriks. Keberhasilan pemisahan protein dengan elektroforesis
dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain buffer, suhu, waktu, dan arus listrik yang digunakan. Buffer berfungsi untuk mempertahankan pH baik
dalam chamber maupun gel serta pembawa muatan listrik Nur dan Adijuwana, 1988. Pada umumnya, buffer yang digunakan bersifat sedikit
alkalis dengan pH sekitar 8-9. Pada pH tersebut, sebagian besar protein bermuatan negatif dan bergerak ke kutub anoda yang biasanya terletak pada
bagian dasar gel. Hal ini mencegah kemungkinan protein untuk bergerak ke atas dari sistem elektroforesis Scopes, 1987. Elektroforesis dilakukan pada
suhu dingin 0-4 C untuk mengurangi kehilangan aktivitas protein akibat
denaturasi dan kerusakan akibat proteolisis Edelstein dan Bollag, 1991. Selain itu, kenaikan suhu yang tinggi selama elektroforesis dapat
menyebabkan pemisahan yang kurang baik. Waktu yang diperlukan untuk elektroforesis berkaitan erat dengan arus listrik yang digunakan. Semakin
15 tinggi arus listrik yang digunakan, maka semakin pendek waktu yang
dibutuhkan, tetapi suhu akan meningkat Nur dan Adijuwana, 1988. Menurut Harris dan Angal 1989, elektroforesis gel poliakrilamida
PAGE adalah metode yang paling banyak digunakan karena memiliki kapasitas pemisahan yang tinggi. Salah satu metode PAGE yang umumnya
digunakan adalah SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis
. Menurut Nur dan Adijuwana 1988, radikal-radikal bebas yang terbentuk
dari ammonium persulfat APS akan bereaksi dengan akrilamida di mana terjadi penyimpanan radikal bebas di dalam molekul akrilamida sehingga
terbentuk akrilamida aktif. Akrilamida aktif ini akan bereaksi dengan cara yang sama dengan akrilamida yang lain sehingga dihasilkan suatu rantai
polimer yang panjang. Gel poliakrilamida terbentuk oleh adanya polimerisasi dari monomer akrilamida dan pembentukan ikatan silang kovalen antar rantai
panjang akrilamida. Cross linking agent yang digunakan adalah N,N’-metilen- bis-akrilamida. Kompleks APS-TEMED mengkatalisa pembentukan radikal
bebas dari persulfat yang selanjutnya berfungsi sebagai inisiator polimerisasi. Lembaran elektroforesis gel poliakrilamida terdiri atas 2 bagian, yaitu gel
penahan stacking gel dan gel pemisah separating gel. Stacking gel terletak pada bagian atas dari separating gel. Stacking gel berfungsi sebagai tempat
dicetaknya sumur untuk memasukkan sampel. Selain itu, stacking gel berfungsi untuk mengkonsentrasikan sampel membentuk pita yang tajam
sebelum memasuki separating gel. Separating gel berfungsi sebagai tempat terjadinya pemisahan protein Nur dan Adijuwana, 1988.
Penambahan SDS pada gel poliakrilamida menghasilkan SDS-PAGE yang digunakan untuk sampel yang terdenaturasi. SDS adalah detergen anionik
yang bersama dengan β-merkaptoetanol dan pemanasan akan merusak struktur
tiga dimensi protein dengan cara memecah ikatan disulfida yang selanjutnya tereduksi menjadi gugus sulfidril. Protein yang terdenaturasi sempurna akan
mengikat SDS dalam jumlah yang setara dengan berat molekul protein tersebut. Setiap 1.4 gram SDS dapat mengikat 1 gram protein Harris dan
Angal, 1989. Pergerakan kompleks SDS-protein yang berukuran besar akan
16 mempunyai mobilitas yang lebih kecil. Adanya gliserol dalam buffer sampel
berfungsi untuk meningkatkan berat jenis larutan sampel sehingga dapat masuk dengan mudah ketika diinjeksi ke dalam sumur gel. Buffer sampel juga
mengandung pewarna bromphenol blue yang berfungsi untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis. Jika pewarna telah mencapai bagian bawah
gel, maka elektroforesis dihentikan Wilson dan Walker, 2000. Sebelum dilakukan prosedur pewarnaan, terlebih dahulu dilakukan proses
fiksasi terhadap gel hasil elektroforesis. Proses fiksasi bertujuan untuk mengendapkan dan mengimobilisasi pita-pita protein pada gel dan
menghilangkan komponen-komponen non protein yang dapat mengganggu pewarnaan seperti SDS. Proses fiksasi dilakukan dengan menggunakan
campuran metanol-asam asetat-air, formaldehid, TCA, atau asam perklorat 5- 10 Scopes, 1987.
Pita-pita protein hasil pemisahan dengan elektoforesis diperjelas dengan teknik pewarnaan. Syarat dari pewarna yang digunakan untuk staining adalah
dapat berikatan kuat dengan protein, tetapi tidak bereaksi dengan gel. Ikatan antara pewarna dan gel adalah ikatan non kovalen sehingga mudah dilepaskan
dengan pencucian secara intensif Scopes, 1987. Proses penghilangan warna destaining dilakukan dengan merendam gel dalam larutan peluntur sampai
diperoleh latar belakang yag relatif jernih sehingga pita-pita protein yang dihasilkan dapat diamati dengan jelas Nur dan Adijuwana, 1988.
Berat molekul protein dapat diketahui dengan membandingkan mobilitas relatif Rf protein dengan protein standar yang berat molekulnya sudah
diketahui. Rf protein merupakan perbandingan jarak antara titik awal ke pita protein dengan titik awal ke titik akhir elektroforesis Wilson dan Walker,
2000.
17
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Bahan dan Alat
