27 licheniformis MB-2 sama dengan Bacillus coagulans LH 28.38 yang
membutuhkan waktu 7 hari pada 55 C Haliza, 2003. Matsuebacter
chitosanotabidus 3001 Park et al., 1999, Amycolatopsis sp. CsO-2 Okajima
et al ., 1994, dan Psedomonas sp. H-14 Yoshihara et al., 1992 membutuhkan
waktu produksi enzim kitosanase sekitar 4 hari pada 28-30 C.
Hasil produksi enzim kitosanase selama 7 hari perlu disentrifugasi untuk memisahkan media yang mengandung enzim kitosanase dengan sel bakteri
sehingga dihasilkan supernatan enzim yang telah bebas dari sel bakteri dan sisa-sisa media yang tidak larut. Proses sentrifugasi dilakukan pada 4
C selama 20 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Sentrifugasi pada suhu dingin
bertujuan untuk meminimalkan kerusakan enzim. Menurut Clark dan Switzer 1977, sel Bacillus licheniformis MB-2 yang berukuran lebih besar
dibandingkan dengan enzim ekstraselulernya akan mengalami gaya sentrifugal yang lebih besar pada kecepatan radian dan jarak putar yang sama. Akibatnya,
sel akan mengendap dan enzim akan tetap berada pada bagian supernatannya.
B. Presipitasi Protein
Supernatan enzim bebas sel diendapkan dengan ammonium sulfat 80. Pengendapan dengan garam menggunakan prinsip salting out di mana
kelarutan protein akan menurun pada konsentrasi garam yang tinggi. Ketika garam ditambahkan ke dalam sistem, air melarutkan ion garam. Jika
konsentrasi garam meningkat, maka air akan lepas dari sekitar protein yang mengakibatkan terjadinya penempelan ikatan hidrofobik dari satu protein
dengan protein yang lain menghasilkan endapan Harris dan Angal, 1989. Penambahan garam dilakukan secara perlahan-lahan pada suhu dingin sambil
di-stirrer karena peningkatan suhu akibat proses pelarutan yang dibantu magnetic stirrer
dapat menyebabkan denaturasi dan perubahan kelarutan. Hal ini dapat dikerjakan dengan mengeliingi wadah pengendapan dengan air yang
dicampur es di dalam wadah yang lebih besar. Pengendapan protein disempurnakan dengan cara supernatan enzim bebas
sel yang telah ditambah garam didiamkan selama semalam di cool room. Selama proses ini molekul-molekul protein akan beragregasi, tetapi tidak
28 semuanya akan langsung mengendap. Sebagian agregat akan melayang atau
terkumpul di permukaan membentuk suatu lapisan. Pemisahan supernatan dan endapan protein dilakukan dengan sentrifugasi. Endapan tersebut dilarutkan
dalam 0.05 M buffer fosfat pH 6 dan disebut sebagai crude enzyme. Pengendapan protein dengan ammonium sulfat 80 menunjukkan
peningkatan aktivitas enzim dan konsentrasi protein. Supernatan enzim bebas sel memiliki aktivitas sebesar 1.076 Uml dengan konsentrasi protein 0.237
mgml. Sedangkan, crude enzyme memiliki aktivitas sebesar 1.087 Uml dengan konsentrasi protein 0.759 mgml. Penambahan ammonium sulfat akan
mengendapkan enzim dan protein-protein lain sehingga terjadi peningkatan aktivitas dan konsentrasi protein pada crude enzyme.
Peningkatan yang tidak terlalu besar dalam aktivitas katalitik enzim diikuti dengan peningkatan yang tajam dalam jumlah protein mengakibatkan
terjadinya penurunan yang cukup tajam dari aktivitas spesifik enzim, yaitu dari 4.539 Umg menjadi 1.433 Umg. Penurunan aktivitas spesifik crude
enzyme diduga karena proteolisis oleh protease endogenous. Sekresi protease
mungkin terjadi karena diinduksi oleh adanya protein dalam media pertumbuhan. Selain itu, penurunan aktivitas spesifik crude enzyme
kemungkinan dikarenakan adanya bagian sisi aktif enzim yang terdenaturasi. Seperti telah diketahui sebelumnya, penggunaan ammonium sulfat kurang
efisien dalam menghilangkan impuritis. Adanya impuritis berupa senyawa- senyawa lain non protein dalam larutan enzim dapat menghalangi kontak
antara enzim dengan substrat sehingga mengurangi efektivitas kerja enzim. Hal ini kemungkinan menyebabkan penurunan aktivitas spesifik crude
enzyme . Kemungkinan lain yang menyebabkan penurunan aktivitas spesifik
crude enzyme adalah penggunaan ammonium sulfat teknis. Adanya logam-
logam dalam ammonium sulfat teknis dapat mengganggu kerja enzim. C. Dialisis
Proses dialisis dilakukan terhadap crude enzyme untuk menghilangkan molekul garam dan ion pengganggu lainnya yang mempengaruhi kestabilan
enzim. Dialisis dilakukan dengan menggunakan kantung selofan. Kantung ini
29 akan melewatkan zat terlarut dengan berat molekul di bawah 10000 Dalton
Morris dan Morris, 1976. Buffer yang digunakan di luar kantung memiliki konsentrasi lebih rendah daripada konsentrasi buffer yang ada di dalam
kantung. Molekul berukuran kecil seperti garam ataupun ion pengganggu lainnya akan melewati pori-pori membran sampai konsentrasi di dalam dan di
luar kantung mencapai nilai yang sama dan larutan buffer masuk ke dalam kantung menggantikan molekul kecil yang keluar Boyer, 1986.
Menurut Harris dan Angal 1989, untuk menghindari kontaminasi dari bahan kimia, maka kantung dialisis terlebih dahulu direbus selama 10 menit
dalam NaHCO
3
dan EDTA lalu dicuci dan direbus kembali dengan air bebas ion selama 10 menit sebanyak 2 kali. Dialisis dilakukan di cool room untuk
mengurangi terjadinya penurunan aktivitas enzim. Pengadukan dengan kecepatan rendah bertujuan untuk mempermudah keluarnya molekul
berukuran kecil dari kantung dialisis dan mencegah molekul tersebut terkonsentrasi di sekitar kantung.
Enzim hasil dialisis menunjukkan adanya penurunan aktivitas enzim, meskipun penurunan aktivitas enzimnya sangat kecil, yaitu menjadi 1.086
Uml. Konsentrasi protein pun mengalami penurunan menjadi 0.531 mgml. Kemungkinan protein non enzim yang berukuran kecil BM 10000 ikut
keluar dari kantung dialisis sehingga larutan enzim cukup murni. Hal ini terlihat dari aktivitas spesifik pada enzim hasil dialisis meningkat
dibandingkan aktivitas spesifik pada crude enzyme, yaitu 2.045 Umg.
D. Pemurnian Enzim Kitosanase
