19 enzim kitosanase sama dengan media yang digunakan untuk pembuatan
kultur starter. Setelah ditumbuhkan dalam media thermus cair selama 7 hari, sel
bakteri dan sisa-sisa media yang tidak larut dipisahkan dengan cara sentifugasi pada 4
C selama 20 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan bebas sel yang diperoleh kemudian ditambah ammonium sulfat
pada tingkat kejenuhan 80. Penambahan ammonium sulfat dilakukan secara perlahan-lahan pada suhu dingin sambil di-stirrer. Setelah itu,
supernatan disimpan selama semalam di cool room. Endapan yang berisi enzim dan beberapa jenis protein lainnya dipisahkan dengan cara
sentrifugasi pada 4 C selama 20 menit dengan kecepatan 10000 rpm.
Endapan tersebut kemudian dilarutkan dalam 0.05 M buffer fosfat pH 6 untuk menjadikan volume larutan sebanyak 8 ml. Larutan enzim yang
diperoleh disebut enzim kasar crude enzyme.
6. Dialisis
Dialisis dilakukan dengan menggunakan kantung selofan yang merupakan turunan membran selulosa dengan cutoff 12000 Dalton.
Kantung dialisis dipotong sesuai kebutuhan kemudian direbus dalam larutan EDTA dan NaHCO
3
selama 10 menit. Setelah dididihkan selama 10 menit, larutan tersebut dibuang dan kantung dialisis direbus kembali
dengan air bebas ion selama 10 menit sebanyak 2 kali. Proses dialisis dilakukan dengan memasukkan crude enzyme sebanyak 4 ml terhadap
kantung tersebut. Setelah itu, kedua ujung kantung diikat dengan benang kasur. Dengan posisi menggantung, kantung tersebut dimasukkan ke
dalam wadah yang berisi 0.025 M buffer fosfat pH 6. Selanjutnya, kantung dialisis di-stirrer selama semalam di cool room.
7. Freeze Dry
Freeze dry bertujuan untuk meningkatkan konsentrasi protein dan
aktivitas enzim. Sebelum freeze dry dilakukan, enzim hasil dialisis sebanyak 3 ml dibekukan terlebih dahulu dalam freezer selama semalam.
20 Enzim yang telah beku kemudian dimasukkan ke dalam tabung dan siap
untuk di-freeze dry. Freeze dry dilakukan sampai volume larutan enzim yang tersisa ±
2 3
dari volume larutan enzim mula-mula ± 2 ml.
8. Pemurnian Enzim Kitosanase Haliza, 2003
Pemurnian enzim kitosanase dilakukan pada suhu dingin. Enzim hasil freeze dry digunakan untuk pemurnian. Enzim ini dimurnikan dengan
menggunakan kromatografi filtrasi gel. Matriks yang digunakan untuk kromatografi filtrasi gel adalah Sephadex G-100. Matriks ini terlebih
dahulu harus dikembangkan swelling sebelum digunakan. Swelling dilakukan dengan merendam Sephadex G-100 dalam akuades pada suhu
dingin selama 3 hari. Setelah itu, gel tersebut divakum dengan menggunakan Millipore untuk menghilangkan gelembung-gelembung
udara yang dapat mengganggu pemurnian. Kolom yang akan digunakan untuk pemurnian harus dibilas terlebih dahulu menggunakan akuades dan
air bebas ion. Matriks dimasukkan secara perlahan ke dalam kolom sambil disetimbangkan dengan 0.05 M buffer fosfat pH 6. Matriks tersebut
dibiarkan memadat selama semalam. Enzim hasil freeze dry sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam kolom. Elusi dilakukan dengan buffer yang sama.
Fraksi dikumpulkan dengan menggunakan fraction collector setiap 100 drop
. Setiap fraksi yang ditampung diukur aktivitas enzim kitosanase dan konsentrasi protein.
9. Elektroforesis SDS-PAGE Edelstein dan Bollag, 1991
