Koloni E. coli galur DH5α yang dapat tumbuh pada media yang mengandung ampisilin adalah koloni yang mengandung plasmid pGEM-T Easy.
Plasmid ini mempunyai gen resistensi ampisilin yang mengekspresikan β- lactamase
yang merusak cincin β-lactame sehingga bakteri yang mengandung plasmid ini dapat hidup dalam media yang mengandung ampisilin. Adanya gen
egl A yang menyisip ke dalam gen lacZ dibuktikan dengan warna koloni yang
putih. Gen lacZ merupakan gen yang menyandi β-galaktosidase yang mengubah substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru. Adanya penyisipan
gen eglA pada gen lacZ mengakibatkan ekspresi gen lacZ terganggu dan β- galaktosidase tidak diekspresikan, sehingga tidak ada perubahan warna pada
substrat X-gal dan koloni yang dihasilkan berwarna putih.
Gambar 10 Koloni E. coli hasil transformasi yang ditumbuhkan dalam media selektif yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG.
Gambar 11 Hasil amplifikasi eglA dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1 bv. Lajur 1. Penanda
1 kb; 2. eglA hasil PCR
4.2.5 Verifikasi pengklonan gen eglA
Untuk memastikan bahwa sisipan pada gen lacZ adalah gen eglA maka dilakukan verifikasi dengan menggunakan PCR-koloni menggunakan primer
Koloni putih Koloni biru
1 2
750 bp 1000 bp
750 bp
1 ml
spesifik eglA maupun pemotongan DNA plasmid dengan enzim EcoRI. PCR- koloni pada koloni putih menghasilkan pita yang berukuran sekitar 750 bp yang
sesuai dengan ukuran eglA Gambar 11. DNA plasmid dari koloni putih diisolasi dan selanjutnya di potong dengan
menggunakan EcoRI. Enzim ini dipilih karena situs pemotongannya mengapit sisipan sehingga diharapkan pemotongan akan menghasilkan dua pita, yaitu DNA
sisipan dan vektor pembawanya. Hasil pemotongan DNA plasmid menunjukkan adanya dua pita yang berukuran sekitar 3000 bp dan 750 bp Gambar 12. Ukuran
sekitar 3000 bp sesuai dengan ukuran pGEM-T Easy, yaitu sebesar 3015 bp, sedangkan ukuran sekitar 750 bp sesuai dengan ukuran produk amplifikasi eglA.
Dari dua hasil verifikasi ini dapat dipastikan bahwa DNA yang menyisip dalam gen lacZ plasmid pGEM-T Easy adalah gen eglA A. niger IPB1.
Gambar 12 Hasil pemotongan DNA plasmid rekombinan dengan EcoRI yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1 bv.
Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. Plasmid rekombinan yang dipotong; 3. Plasmid rekombinan yang tidak dipotong
4.3 Pengurutan dan Karakterisasi Gen eglA A. niger IPB1 4.3.1 Pengurutan gen eglA dan deduksi asam aminonya
Pengurutan gen eglA A. niger IPB1 pada pGEM-T Easy dilakukan menggunakan ABI Prism 3100 versi 3.7 dengan primer sp6 dan T7 Lampiran 4.
Dari hasil pengurutan diperoleh gen eglA A. niger IPB1 sebesar 720 bp yang menyandi 239 asam amino Gambar 13.
1 2 3 vektor
750 bp 1000 bp
3000 bp
sisipan
Gambar 13 Urutan nukleotida eglA A. niger IPB1 dan deduksi asam aminonya
4.3.2 Analisis kesejajaran urutan nukleotida dan asam amino eglA A. niger IPB1
dengan database di GenBank
Analisis kesejajaran urutan nukleotida dan asam amino eglA A. niger IPB1 dengan database di GenBank dilakukan menggunakan program BLAST Basic
Local Alignment Search Tool . Hasil penyejajaran nukleotida menunjukkan
sekuen eglA A. niger IPB1 mempunyai kemiripan 99 dengan sekuen 14 dari paten WO2004018662 E-value
3.7e-152
, 98 dengan sekuen 1 dari paten WO9713853 E-value
1.7e-151
, WO9713862 E-value
1.7e-151
, US6190890 E- value
1.7e-151
, US6306635 E-value
1.7e-151
, dan 97 dengan sekuen 13 dari paten WO2004018662 E-value
4.5e-149
dan eglA Aspergillus niger CBS 513.88 E-value
1.1e-148
yang semuanya merupakan gen endoglukanase dari Aspergillus niger
. Sementara itu hasil penyejajaran urutan asam amino menunjukkan urutan egl
A mempunyai kemiripan 99 dengan endoglukanase A atau eglA dari Aspergillus niger
A. niger E-value
7.1e-127
, 87 dengan endoglukanase A atau cek
A dari Aspergillus kawachi E-value 1.9e-126 , 81 dengan endoglukanase A
Sequence ID : EglA_niger Nuk AA atgaagctccccgtgacacttgctatgcttgcggccaccgccatgggccagacgatgtgc 60
M K L P V T L A M L A A T A M G Q T M C 20 tctcaatatgacagtgcctcgagccccccatattcagtgaaccagaacctctggggcgag 120
S Q Y D S A S S P P Y S V N Q N L W G E 40 taccaaggcaccggcagccagtgtgtatatgtcaacaaactctccagcagtggtgcatcc 180
Y Q G T G S Q C V Y V N K L S S S G A S 60 tggcacaccgaatggacctggagcggtggtgagggaacagtgaaaagctactctaactct 240
W H T E W T W S G G E G T V K S Y S N S 80 ggcgttacatttaacaagaagctcgtgagtgatgtatcaagcatccccacctcggtggaa 300
G V T F N K K L V S D V S S I P T S V E 100 tggaagcaggacaacaccaacgtcaacgccgatgtcgcgtatgatcttttcaccgcagcg 360
W K Q D N T N V N A D V A Y D L F T A A 120 aatgtggaccatgctacttctagcggtgactatgaactgatgatttggcttgcccgctac 420
N V D H A T S S G D Y E L M I W L A R Y 140 ggcaacatccagcccattggcaagcaaattgccacggccacagtgggaggcaagtcctgg 480
G N I Q P I G K Q I A T A T V G G K S W 160 gaggtgtggtatggcagcaccacccaggccggtgcggagcagaggacatacagcttcgtg 540
E V W Y G S T T Q A G A E Q R T Y S F V 180 tcggaaagccctatcaactcatacagtggggccatcaatgcatttttcagctatctcact 600
S E S P I N S Y S G A I N A F F S Y L T 200 cagaaccaaggctttcccgccagctctcagtacttgatcaatctgcagtttggaactgag 660
Q N Q G F P A S S Q Y L I N L Q F G T E 220 gcgttcaccgggggcccggcaaccttcacggttgacaactggaccgccagtgtcaactag 720
A F T G G P A T F T V D N W T A S V N - 239
dari Aspergillus terreus E-value 6.9e-113 dan 75 dengan endoglukanase atau cel
A dari Aspergillus oryzae E-value 4.8e-105 Lampiran 5 dan 6. BLAST merupakan program pencari similaritas suatu urutan nukleotida
atau asam amino dengan database yang berbasis local alignment, yaitu penyejajaran pada suatu segmen sekuen yang lebih pendek dengan derajat
similaritas yang sangat tinggi. Similaritas mengindikasikan homologi suatu gen atau protein. Jika kedua urutan gen atau protein homolog maka dapat dikatakan
bahwa keduanya mempunyai leluhur, fungsi dan struktur yang sama. Dua gen atau fragmen DNA dikatakan homolog jika 70 urutan nukleotidanya atau 25 urutan
asam aminonya identik panjang urutan minimal 100 Claviere Notredame 2003. Berdasarkan hal diatas maka dapat dipastikan bahwa eglA merupakan gen
egl A dari Aspergillus niger.
Gambar 14 Peta situs pemotongan eglA dengan menggunakan program NEBcutter
4.3.3 Analisis situs pemotongan gen eglA
