Tabel 5 Hasil isolasi RNA total
Absorban Bahan
λ
260
λ
280
λ
260
λ
280
Total RNA g g miselium
Miselium A. niger IPB1 0.210
0.122 1.72
176.4
Gambar 7 Hasil isolasi RNA total A. niger IPB1 yang diisolasi dari miselium
setelah inkubasi 3 hari yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1 bv.
4.2.2 Sintesis cDNA total
Sintesis cDNA dilakukan menggunakan RNA total yang telah diisolasi sebagai cetakan melalui proses transkripsi balik. Proses ini menggunakan primer
oligodT sehingga hanya mRNA yang akan disintesis menjadi cDNA karena adanya ekor poliA pada ujung 3’. Sebagai kontrol keberhasilan sintesis cDNA,
dilakukan amplifikasi terhadap gen aktin menggunakan primer spesifik ActF dan Act
R2. Hasil amplifikasi gen aktin dengan cDNA sebagai cetakan menghasilkan
satu pita DNA yang berukuran 123 bp Gambar 8. Hasil ini menunjukkan bahwa sintesis cDNA total telah berlangsung dengan baik. Selain itu, hasil ini juga
menunjukkan RNA yang dihasilkan tidak terkontaminasi oleh DNA genom. Adanya kontaminasi oleh DNA akan ditunjukkan dengan adanya dua pita DNA
yang dihasilkan, yaitu pita berukuran 123 bp yang menunjukkan hasil amplifikasi cDNA dan pita berukuran 223 bp yang menunjukkan hasil amplifikasi DNA
rRNA 28S rRNA 18S
genom. Pada DNA genom terdapat intron antara ekson1 dan ekson2 sehingga fragmen yang dihasilkan lebih besar.
Gambar 8 Hasil amplifikasi gen aktin dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 3 bv. Lajur 1. Penanda
Φ X174RF DNAHaeIII Fragments; 2. Gen aktin
4.2.3 Isolasi gen eglA
Hasil sintesis cDNA selanjutnya digunakan sebagai cetakan untuk mengisolasi gen eglA. Isolasi gen eglA dilakukan dengan amplifikasi
menggunakan PCR dengan primer spesifik EAF dan EAR. Amplifikasi gen eglA A. niger
IPB1 menghasilkan pita sekitar 750 bp sesuai dengan hasil prediksi dari database Gambar 9.
Gambar 9 Hasil amplifikasi eglA dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1 bv. Lajur 1. Penanda 1
kb; 2. eglA hasil PCR
4.2.4 Pengklonan gen eglA
Gen eglA hasil isolasi disisipkan dalam plasmid pGEM-T Easy, ditengah gen lacZ dengan bantuan enzim ligase. Hasil ligasi kemudian diintroduksikan ke
dalam E. coli galur DH5α yang selanjutnya ditumbuhkan dalam media seleksi yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG. Keberhasilan pengklonan gen eglA
dapat diketahui dengan terbentuknya koloni putih Gambar 10.
310 bp 194 bp
123 bp
1 2
118 bp
750 bp 750bp
1000 bp 1 2
Koloni E. coli galur DH5α yang dapat tumbuh pada media yang mengandung ampisilin adalah koloni yang mengandung plasmid pGEM-T Easy.
Plasmid ini mempunyai gen resistensi ampisilin yang mengekspresikan β- lactamase
yang merusak cincin β-lactame sehingga bakteri yang mengandung plasmid ini dapat hidup dalam media yang mengandung ampisilin. Adanya gen
egl A yang menyisip ke dalam gen lacZ dibuktikan dengan warna koloni yang
putih. Gen lacZ merupakan gen yang menyandi β-galaktosidase yang mengubah substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru. Adanya penyisipan
gen eglA pada gen lacZ mengakibatkan ekspresi gen lacZ terganggu dan β- galaktosidase tidak diekspresikan, sehingga tidak ada perubahan warna pada
substrat X-gal dan koloni yang dihasilkan berwarna putih.
Gambar 10 Koloni E. coli hasil transformasi yang ditumbuhkan dalam media selektif yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG.
Gambar 11 Hasil amplifikasi eglA dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1 bv. Lajur 1. Penanda
1 kb; 2. eglA hasil PCR
4.2.5 Verifikasi pengklonan gen eglA
