diinkubasikan dalam es selama 20 menit. Transformasi dilakukan dengan mencampur sel bakteri kompeten yang dihasilkan dengan 10 l plasmid hasil
ligasi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Campuran kemudian diberikan kejutan panas dengan diinkubasi pada suhu 42
o
C selama 1 menit dan setelah itu diinkubasikan kembali dalam es selama 5 menit. Campuran kemudian ditambah
dengan 200 l media YT 16 gl tripton, 10 gl ekstrak yeast, 5 gl NaCl, pH 7,0 dan diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama 60 menit. Bakteri kemudian disebar dalam media agar LB yang mengandung 50 gml ampisilin, 10 l 100 mM
isopropiltio-β-galaktosida IPTG dan 50 l 2 bv X-gal 5-bromo-4-chloro-3- indolyl
-β-D-galactoside dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama semalam.
3.3.3.5 Seleksi transforman rekombinan
E. coli DH5α yang mengandung vektor rekombinan diseleksi
menggunakan seleksi resistensi terhadap ampisilin dan seleksi biru putih. Koloni yang tumbuh berarti bakteri transforman, sebab E. coli DH5α baru memiliki gen
amp ketahanan terhadap ampisilin setelah ditransformasi oleh pGEM-T Easy.
Ada dua jenis warna koloni yang tumbuh yaitu koloni biru dan putih. Koloni biru berarti bakteri transforman pGEM-T Easy non rekombinan, sehingga
gen lacZ masih utuh dan menghasilkan enzim β-galaktosidase untuk memotong substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru. Koloni putih berarti
bakteri transforman yang mengandung pGEM-T Easy rekombinan, karena gen lac
Z menjadi rusak karena tersisipi oleh fragmen DNA insertional inactivation dan tidak akan menghasilkan enzim β-galaktosidase.
3.3.3.6 Analisis cDNA sisipan
Analisis cDNA sisipan dilakukan melalui PCR terhadap koloni putih yang dihasilkan dan pemotongan plasmid rekombinan dengan enzim restriksi EcoRI.
Koloni putih yang terbentuk digunakan sebagai cetakan untuk reaksi PCR dalam mendeteksi keberadaan gen endoglukanase. Koloni putih diambil dengan tusuk
gigi steril kemudian disuspensikan ke dalam 7.42 l ddH
2
O dan dipanaskan dalam waterbath
pada suhu 95
o
C selama 10 menit dan didinginkan dalam es selama 5
menit. Reaksi PCR dilakukan dengan campuran dan kondisi reaksi yang sama dengan isolasi cDNA eglA.
Koloni putih yang menghasilkan pita sesuai dengan ukuran fragmen cDNA sisipan setelah PCR terhadap koloni digunakan sebagai bahan untuk isolasi
plasmid yang akan dianalisis lebih lanjut. Plasmid diisolasi dari E. coli DH5α transforman rekombinan menggunakan prosedur Suharsono 2002. E. coli
ditumbuhkan dalam 2 ml media LB dan diinkubasi dalam inkubator beragitasi 250 rpm pada suhu 37
o
C semalam. Kultur bakteri di sentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4
o
C selama 10 menit. Pelet disuspensikan dengan 100 l coldTEG buffer 50 mM glukosa, 25 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA,
ditambahkan 200 l NaOHSDS buffer 1 N NaOH, 1 SDS, dibolak-balik perlahan dan diinkubasi dalam es selama 5 menit, selanjutnya ditambahkan 300 l
icecalsal buffer 3 M NaOAc, 11.5 asam asetat glasial, ddH
2
O, dihomogenkan dan disimpan dalam es selama 3 menit. Larutan disentrifugasi 12000 rpm pada
suhu 4
o
C selama 10 menit. Supernatan disuspensikan dengan 1x volume PCI fenol:kloroform:isoamil alkohol 25:24:1, diinkubasi selama 10 menit pada
suhu ruang dan selanjutnya disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan ditambah 2x volume etanol absolut, diinkubasi selama 2 jam di freezer dan
selanjutnya disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Pelet dikeringkan dan kemudian ditambahkan 30 l ddH
2
O. RNA didegradasi dengan menambahkan 100 ppm RNAse dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit. Plasmid dielektroforesis di agarosa 1 bv dalam bufer TAE 1x 40 mM Tris-asetat, 1
mM EDTA pada tegangan 100 volt selama 30 menit.
3.3.4 Pengurutan nukleotida dan analisis urutan nukleotida
