Aktivitas masing-masing enzim selulase dapat diuji menggunakan berbagai substrat selulosa maupun turunannya. Pada umumnya substrat ini dibagi
menjadi dua kategori berdasarkan kelarutannya dalam air, yaitu substrat yang larut dalam air dan substrat yang tidak larut dalam air Tabel 2. Substrat larut dalam
air meliputi selodekstrin dengan DP degree of polymerization rendah dari 2 sampai 6 unit gula dan turunannya. Sementara itu substrat tidak larut meliputi
selulosa yang hampir murni seperti katun, kertas saring Whatman no.1 dan selulosa bakteri, serta selulosa yang tidak murni seperti α-selulosa. Aktivitas
enzim endoglukanase pada umumnya dapat diuji dengan substrat CMC carboxymethyl cellulose sehingga enzim endoglukanase juga dikenal dengan
istilah CMCase. Sementara itu aktivitas enzim selobiohidrolase atau eksoglukanase seringkali diuji dengan substrat avicel sehingga enzim
eksoglukanase disebut juga avicelase Zhang et al. 2006.
2.2.2 Struktur organisasi enzim selulase
Pada umumnya enzim selulase terdiri dari dua domain utama, yaitu domain katalitik dan carbohydrate binding moduls CBM. Kedua domain ini
biasanya dihubungkan oleh suatu penghubung yang pendek dan fleksibel linker. Domain katalitik merupakan bagian terbesar dari enzim dan merupakan tempat
dimana hidrolisis selulosa terjadi. Enzim selulase sedikitnya mempunyai satu domain katalitik dan ukurannya bervariasi tiap organisme, dari yang berukuran
pendek seperti CelS Erwinia corotovora 232 AA sampai yang berukuran panjang seperti CelBb Caldochellum saccharolyticum 1.011 AA Gilkes 1991.
Carbohydrate binding modul CBM sebelumnya dikenal dengan cellulose
binding domain . Saat ini CBM diklasifikasikan menjadi 45 famili berdasarkan
database CAZy Hashimoto 2006. Domain CBM merupakan daerah yang miskin asam amino bermuatan, mempunyai kandungan asam hidroksiamino yang tinggi
dan mengandung residu-residu Trp, Tyr dan Gly yang terkonservasi Gilkes 1991. Fungsi utama domain CBM adalah meningkatkan efisiensi katalitik enzim
terhadap substrat dengan membawa modul katalitik pada substrat Hashimoto 2006.
Daerah penghubung linker merupakan daerah yang menghubungkan antara CBM dan domain katalitik Gilkes 1991. Linker mempunyai ukuran yang
pendek dan sangat bervariasi, dari 6-59 asam amino. Daerah ini kaya prolin, treonin dan serin. Linker berperan dalam menjaga jarak antara domain katalitik
dan CBM. Percobaan yang dilakukan dengan menghilangkan daerah linker pada Cel7A T. reesei menunjukkan penurunan kecepatan degradasi selulosa kristalin
secara drastis Srisodsuk et al. 1993.
2.2.3 Mekanisme hidrolisis oleh selulase
Hidrolisis enzimatik ikatan glikosidik oleh golongan glikosil hidrolase biasanya dilakukan melalui katalisis asam atau basa yang memerlukan dua residu,
yaitu donor proton HA dan nukleofil basa B
-
. Aktivitas katalitik ini disediakan oleh residu asam aspartat atau glutamat. Terdapat dua mekanisme yang dapat
dibedakan, yaitu retaining mechanism dan inverting mechanism Gambar 2 Davies Henrissat 1995.
Pada retaining mechanism, reaksi tejadi melalui mekanisme penggantian ganda. Pada tahap pertama, salah satu gugus karboksilat berfungsi sebagai katalis
asam yang memprotonisasi oksigen dan secara bersamaan karbon C1 diserang oleh nukleofil B
-
dari gugus karboksilat kedua, menghasilkan bentuk antara enzim-glikosil. Pada tahap kedua, gugus karboksilat pertama sekarang berfungsi
sebagai katalis basa yang mengaktifkan molekul air. Aktivasi ini menghasilkan nukleofil yang menghidrolisis bentuk antara enzim-glikosil, menghasilkan produk
yang mempunyai stereokimia yang sama dengan substrat. Retaining mechanism ini biasanya terjadi pada dua karboksilat yang berjarak 5.5 Å. Sementara itu, pada
inverting mechanism , terjadi pengubahan konfigurasi pada karbon C1 anomerik
setelah pemutusan ikatan glikosidik. Reaksi terjadi melalui mekanisme penggantian tunggal. Basa B
-
melakukan deprotonasi molekul air yang kemudian menyerang karbon C1 dari cincin glukosa, menghasilkan pembalikan
konfigurasi pada karbon C1 anomerik. Inverting mechanism ini biasanya terjadi pada dua karboksilat yang berjarak antara 6.5-9.5 Å.
Gambar 2 Mekanisme hidrolisis oleh selulase. a. Retaining mechanism b. Inverting mechanism
2.3 Glikosida Hidrolase Famili 12
