3.3.1 Pemeliharaan biakan cendawan
Isolat-isolat Aspergillus niger dan Trichoderma dipelihara dalam media agar CMC carboxymethyl cellulose dan diinkubasikan pada suhu ruang selama 7
hari yang selanjutnya digunakan sebagai sumber inokulum.
Gambar 5 Skema urutan tahapan penelitian
3.3.2 Uji aktivitas selulolitik 3.3.2.1 Uji aktivitas selulolitik secara kualitatif
Uji kualitatif aktivitas enzim endoglukanase dilakukan sesuai dengan metode Onsori et al. 2004 yang dimodifikasi dengan mengukur zona bening
yang terbentuk pada media agar CMC CMC 1 bv, ekstrak yeast 0.05 bv, MgSO
4
0.05 bv, NaNO
3
0.2 bv dan KH
2
PO
4
0.1 bv, KCl 0.05 bv, agar 1.5 bv. Sebagai standar digunakan isolat Trichoderma reesei yang
merupakan standar aktivitas enzim selulase. Secara garis besar metode yang digunakan adalah sebagai berikut. Koloni dengan diameter sepuluh mm dari
masing-masing isolat hasil peremajaan diinokulasikan ke dalam media agar CMC. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama satu hari. Untuk mengetahui
aktivitas selulolitik cendawan, biakan berumur 1 hari diwarnai dengan pewarna
Koleksi isolat TAHAP I
Skrining enzim endoglukanase TAHAP II
Isolasi gen penyandi enzim endoglukanase
Isolat potensial terpilih
Uji kualitatif aktivitas enzim endoglukanase
Uji kuantitatif aktivitas enzim endoglukanase
Desain primer
Isolasi gen penyandi enzim endoglukanase
Sekuensing dan karakterisasi DNA
congo red 1 bv selama 0.5-1 jam, diikuti destaining dengan larutan NaCl 1
M selama 15 menit. Adanya aktivitas enzim endoglukanase ditandai dengan terbentuknya zona bening. Untuk masing-masing isolat digunakan tiga ulangan.
Diameter koloni dan zona bening yang terbentuk diukur. Nisbah selulolitik dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
koloni diameter
koloni diameter
- zona
diameter R
selulotik Nisbah
=
3.3.2.2 Uji aktivitas enzim endoglukanase secara kuantitatif
Sebanyak 2 x 10
6
sporaml A. niger dan Trichoderma yang diproduksi pada media agar CMC diinokulasikan ke dalam 50 ml media CMC cair dalam erlenmeyer 250
ml Narashima et al. 2006. Untuk masing-masing isolat digunakan tiga ulangan. Kultur diinkubasi dalam inkubator beragitasi selama 7 hari pada kecepatan 150
rpm. Kultur di panen pada umur 7 hari setelah inokulasi. Pemisahan enzim kasar dari biomassa cendawan dilakukan dengan cara menyaring filtrat kasar cendawan
dengan kertas saring. Filtrat yang dihasilkan digunakan sebagai ekstrak kasar enzim. Aktivitas enzim endoglukanase diukur berdasarkan produk gula yang
dihasilkan dengan metode DNS asam dinitrosalisilat Ghose 1987. Sebanyak 0.5 ml filtrat ekstrak kasar enzim dicampur dengan 0.5 ml CMC 1 bv dalam
bufer sitrat 50 mM pH 4,8 dan diinkubasikan selama 30 menit pada suhu 50
o
C. Reagen DNS sebanyak 3 ml ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Setelah itu
tabung reaksi dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit, kemudian didinginkan pada suhu kamar dan dihitung nilai rapat optis O.D pada λ540 nm
terhadap blanko. Blanko dibuat dengan mengganti sampel dengan bufer sitrat 50 mM pH 4.8. Hasil pengukuran kemudian dimasukkan ke dalam persamaan kurva
standar glukosa yang telah dibuat untuk mengukur kadar glukosa Lampiran 1. Unit aktivitas enzim endoglukanase dihitung dengan rumus dibawah ini. Satu unit
aktivitas enzim endoglukanase didefinisikan sebagai kemampuan enzim dalam menghasilkan 1 mol glukosa per menit.
n pengencera
faktor x waktu
ml enzim
V x
glukosa BM
ppm glukosa
i konsentras
Unit x
=
Pengukuran kadar protein total dilakukan dengan metode Lowry Ghose, 1987. Sebanyak 0.5 ml ekstrak kasar enzim dimasukkan kedalam tabung reaksi
dan setelah itu ditambahkan 5 ml reagen C. Reagen C dibuat dengan mencampur 100 ml reagen A Na
2
CO
3
2 bv dalam NaOH 0.1N dan 2 ml reagen B CuSO
4
.5H
2
O 0.5 bv dalam K Tartarat 1 bv. Tabung kemudian divorteks dan didiamkan pada suhu kamar selama 10 menit. Setelah itu, ke dalam
tabung dimasukkan 0.5 ml Reagen D reagen folin Ciocalteau yang telah diencerkan dengan air sampai 1N. Tabung kemudian divorteks dan didiamkan
pada suhu kamar selama 30 menit. Nilai rapat optis O.D setiap isi tabung dibaca dengan menggunakan spektrofotometer pada λ750 nm terhadap blanko. Hasil
pengukuran kemudian dimasukkan ke dalam persamaan kurva standar bovine serum albumin
BSA yang telah dibuat untuk mengukur kadar protein Lampiran 1. Selanjutnya aktivitas spesifik enzim dapat ditentukan berdasarkan unitml
aktivitas enzim dan kadar protein yang didapat dengan rumus sebagai berikut.
mgml protein
kadar unitml
unit aktivitas
unitmg spesifik
aktivitas =
3.3.3 Isolasi gen penyandi endoglukanase A. niger IPB1 3.3.3.1 Isolasi RNA total
Isolasi asam ribonukleat RNA total A. niger IPB1 dilakukan pada biakan yang berumur 3 hari. Miselium dari biakan A. niger IPB1 yang ditumbuhkan pada
media cair dipanen. Sebanyak 1 g miselium digerus dengan bantuan nitrogen cair dalam mortal sampai terbentuk bubuk halus, kemudian diekstrak dengan 800 l
reagen TRIzol Invitrogen. Inkubasi dilakukan selama 5 menit pada suhu ruang, selanjutnya ditambahkan 200 l kloroform, dibolak-balik selama 30 detik.
Campuran diinkubasi selama 3 menit pada suhu ruang, selanjutnya disentrifugasi pada 9000 rpm Jouan BR4i selama 15 menit pada suhu 6
o
C. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan 500 l isopropil
alkohol, kemudian diinkubasikan selama 10 menit pada suhu ruang dan disentrifugasi pada 9000 rpm Jouan BR4i selama 10 menit pada suhu 6
o
C. Supernatan dibuang dan endapannya dicuci dengan etanol 75 vv dan
disentrifugasi pada 5700 rpm Jouan BR4i selama 5 menit pada suhu 6
o
C. Endapan yang didapat dikeringkan dengan vakum selama 6 menit dan dilarutkan
dalam 20 l ddH
2
O yang mengandung diethylpyrocarbonate DEPC 0.1 vv. Kuantifikasi dilakukan dengan melarutkan 1 l suspensi RNA total dalam 700 l
air DEPC 0.1 vv, selanjutnya dibaca nilai rapat optisnya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm Sambrook et al. 1989.
Keutuhan RNA dianalisis secara kualitatif menggunakan elektroforesis, dengan memigrasikan RNA pada gel agarosa di dalam bufer morpholinopropanesulfonic
acid MOPS 1 vv 4,2 gl 3-morpholinopropanesulfonic acid C
7
H
15
NO
4
, 0.41 gl Na-Asetat, 0.37 gl Na
2
EDTA.H
2
O pada tegangan 100 volt selama 35 menit. Visualisasi RNA dilakukan di atas UV transiluminator GelDoc Labquip.
3.3.3.2 Sintesis cDNA total
Sintesis cDNA total dilakukan melalui proses transkripsi balik. Sebanyak 500 ng RNA total dicampur dengan 4 l 5x reverse transcriptase RT bufer, 1
unit Enzim reverse transcriptase Invitrogen, 10 pmol primer oligo dT, 2 l dithiothreitol
DTT 0.1 M, 2 l dNTPmix 2 mM dan ddH
2
O DEPC 0.1 steril konsentrasi final dalam volume 20 l. Reaksi transkripsi balik dilakukan pada
suhu 30
o
C selama 10 menit, diikuti oleh suhu 42
o
C selama 60 menit dan 95
o
C selama 5 menit.
Evaluasi terhadap keberhasilan sintesis cDNA total dilakukan dengan mengamplifikasi gen penyandi aktin dengan menggunakan primer spesifik gen
aktin dan cDNA total sebagai cetakannya. Komposisi reaksi PCR polymerase chain reaction
ialah 0.75 l cDNA total, 1x bufer Taq, 0.25 unit Taq DNA polimerase, 2 mM MgCl
2
, 0.2 mM dNTPs, 15 pmol dari masing-masing primer Act
F dan ActR2, dimethyl sulfoxide DMSO 4 vv konsentrasi final dan ddH
2
O dengan volume reaksi 15 l. Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi pra- PCR 95
o
C selama 5 menit diikuti dengan 30 siklus amplifikasi yang terdiri dari denaturasi 94
o
C selama 30 detik, annealing 57
o
C selama 30 detik, dan polimerisasi 72
o
C selama 2 menit dan pasca-PCR 72
o
C selama 5 menit dan pendinginan 15
o
C selama 5 menit
3.3.3.3 Isolasi fragmen cDNA eglA
Fragmen cDNA eglA diisolasi dengan PCR menggunakan primer spesifik gen endoglukanase yang telah didesain. Komposisi PCR ialah 1 l cDNA total, 1x
bufer Taq, 0.25 unit Taq DNA polimerase, 2 mM MgCl
2
, 0.2 mM dNTPs, 20 pmol dari masing-masing primer forward dan reverse, DMSO 4 vv
konsentrasi final dan ddH
2
O dengan volume reaksi 20 l. PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR 95
o
C selama 5 menit diikuti dengan 30 siklus amplifikasi yang terdiri dari denaturasi 94
o
C selama 30 detik, annealing 57
o
C selama 30 detik, dan polimerisasi 72
o
C selama 2 menit dan pasca-PCR 72
o
C selama 5 menit dan pendinginan 15
o
C selama 5 menit.
3.3.3.4 Pengklonan fragmen cDNA eglA
Fragmen cDNA eglA yang telah diisolasi disisipkan ke dalam vektor pengklonan pGEM-T Easy Promega, Madison, WI, USA Lampiran 2 dan
diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α. Hasil PCR diligasikan dengan pGEM-T Easy mengikuti petunjuk produsen Promega yaitu dengan mencampur
7.5 ng hasil PCR, 10 ng pGEM-T Easy, 0.3 Weiss Unit T4 DNA ligase dan 1x bufer ligasi dengan volume reaksi 10 l, kemudian diinkubasi pada suhu 4
o
C selama semalam. Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α
menggunakan metode Suharsono 2002. Metode ini dilakukan dalam dua tahap, yaitu pembuatan sel kompeten dan transformasi bakteri. Sel kompeten dibuat
dengan membiakkan koloni tunggal E.coli DH5α dalam 2 ml media LB Luria- Bertani cair tripton 1 bv, ekstrak yeast 0.5 bv, NaCl 1 bv pada
suhu 37
o
C selama semalam dalam inkubator beragitasi 250 rpm. Sebanyak 100 l biakan E.coli DH5α kemudian dibiakkan kembali dalam 10 ml media LB cair
sampai mencapai OD
600
=O.5 densitas sel 4.10
7
– 7.10
7
selml. Sebanyak 1.5 ml biakan bakteri diendapkan dengan senrifugasi pada kecepatan 5000 rpm, suhu 4
o
C selama 10 menit. Endapan bakteri kemudian disuspensikan dalam 600 l bufer
transformasi TB 10 mM PIPES, 15 mM CaCl
2
.2H
2
O, 250 mM KCl, 55 mM MnCl
2
, pH 6,7 dan diinkubasikan dalam es selama 20 menit. Setelah disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4
o
C selama 10 menit, endapan bakteri diresuspensikan dengan 60 l TB, ditambah 4.2 l DMSO dan
diinkubasikan dalam es selama 20 menit. Transformasi dilakukan dengan mencampur sel bakteri kompeten yang dihasilkan dengan 10 l plasmid hasil
ligasi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Campuran kemudian diberikan kejutan panas dengan diinkubasi pada suhu 42
o
C selama 1 menit dan setelah itu diinkubasikan kembali dalam es selama 5 menit. Campuran kemudian ditambah
dengan 200 l media YT 16 gl tripton, 10 gl ekstrak yeast, 5 gl NaCl, pH 7,0 dan diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama 60 menit. Bakteri kemudian disebar dalam media agar LB yang mengandung 50 gml ampisilin, 10 l 100 mM
isopropiltio-β-galaktosida IPTG dan 50 l 2 bv X-gal 5-bromo-4-chloro-3- indolyl
-β-D-galactoside dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama semalam.
3.3.3.5 Seleksi transforman rekombinan
E. coli DH5α yang mengandung vektor rekombinan diseleksi
menggunakan seleksi resistensi terhadap ampisilin dan seleksi biru putih. Koloni yang tumbuh berarti bakteri transforman, sebab E. coli DH5α baru memiliki gen
amp ketahanan terhadap ampisilin setelah ditransformasi oleh pGEM-T Easy.
Ada dua jenis warna koloni yang tumbuh yaitu koloni biru dan putih. Koloni biru berarti bakteri transforman pGEM-T Easy non rekombinan, sehingga
gen lacZ masih utuh dan menghasilkan enzim β-galaktosidase untuk memotong substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru. Koloni putih berarti
bakteri transforman yang mengandung pGEM-T Easy rekombinan, karena gen lac
Z menjadi rusak karena tersisipi oleh fragmen DNA insertional inactivation dan tidak akan menghasilkan enzim β-galaktosidase.
3.3.3.6 Analisis cDNA sisipan
Analisis cDNA sisipan dilakukan melalui PCR terhadap koloni putih yang dihasilkan dan pemotongan plasmid rekombinan dengan enzim restriksi EcoRI.
Koloni putih yang terbentuk digunakan sebagai cetakan untuk reaksi PCR dalam mendeteksi keberadaan gen endoglukanase. Koloni putih diambil dengan tusuk
gigi steril kemudian disuspensikan ke dalam 7.42 l ddH
2
O dan dipanaskan dalam waterbath
pada suhu 95
o
C selama 10 menit dan didinginkan dalam es selama 5
menit. Reaksi PCR dilakukan dengan campuran dan kondisi reaksi yang sama dengan isolasi cDNA eglA.
Koloni putih yang menghasilkan pita sesuai dengan ukuran fragmen cDNA sisipan setelah PCR terhadap koloni digunakan sebagai bahan untuk isolasi
plasmid yang akan dianalisis lebih lanjut. Plasmid diisolasi dari E. coli DH5α transforman rekombinan menggunakan prosedur Suharsono 2002. E. coli
ditumbuhkan dalam 2 ml media LB dan diinkubasi dalam inkubator beragitasi 250 rpm pada suhu 37
o
C semalam. Kultur bakteri di sentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4
o
C selama 10 menit. Pelet disuspensikan dengan 100 l coldTEG buffer 50 mM glukosa, 25 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA,
ditambahkan 200 l NaOHSDS buffer 1 N NaOH, 1 SDS, dibolak-balik perlahan dan diinkubasi dalam es selama 5 menit, selanjutnya ditambahkan 300 l
icecalsal buffer 3 M NaOAc, 11.5 asam asetat glasial, ddH
2
O, dihomogenkan dan disimpan dalam es selama 3 menit. Larutan disentrifugasi 12000 rpm pada
suhu 4
o
C selama 10 menit. Supernatan disuspensikan dengan 1x volume PCI fenol:kloroform:isoamil alkohol 25:24:1, diinkubasi selama 10 menit pada
suhu ruang dan selanjutnya disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan ditambah 2x volume etanol absolut, diinkubasi selama 2 jam di freezer dan
selanjutnya disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Pelet dikeringkan dan kemudian ditambahkan 30 l ddH
2
O. RNA didegradasi dengan menambahkan 100 ppm RNAse dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit. Plasmid dielektroforesis di agarosa 1 bv dalam bufer TAE 1x 40 mM Tris-asetat, 1
mM EDTA pada tegangan 100 volt selama 30 menit.
3.3.4 Pengurutan nukleotida dan analisis urutan nukleotida
Pengurutan fragmen cDNA eglA dilakukan menggunakan DNA sequencer ABI Prism Model 3100 versi 3.7 di Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi.
Urutan nukleotida gen endoglukanase yang dihasilkan dianalisis menggunakan beberapa program yang tersedia. Analisis homologi urutan nukleotida yang
dihasilkan terhadap organisme lain dilakukan menggunakan program BLAST2 basic local alignment search tool
http:www.ebi.ac.ukblast2 , deduksi asam
amino dilakukan
dengan menggunakan
program Translate
Tools
http:expasy.chtoolstranslate Gasteiger et al. 2003, analisis situs pemotongan
dilakukan dengan menggunakan program NEBcutter http:tools.neb.com
NEBcutter Vincze et al. 2003, analisis hidrofobisitas dilakukan dengan
menggunakan program ProtScale
pada http:www.expasy.chcgi-
binprotscale.pl dan TMHMM
http:cbs.dtu.dkservicesTMHMM-2.0 Claverie
Notredame 2003; Gasteiger et al. 2003, analisis domain dilakukan dengan menggunakan program Pfscan
http:hits.isb-sib.chcgi-binPFSCAN Claverie
Notredame 2003, multiple sequence alignment dilakukan dengan program Tree based Consistency Objective Function For alignmEnt Evaluation
T-COFFEE Notredame et al. 2000, visualisasi multiple sequence alignment dengan program
Chroma Goodstadt Ponting 2001 dan konstruksi pohon filogenetik dengan program phylogeny inference package PHYLIP
http:bioweb.pasteur.fr seqanalphylogenyphylip-uk.html
dan visualisasi pohon filogenetik dengan program njplot versi 2.3.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Uji Aktivitas Selulolitik
4.1.1 Uji aktivitas selulolitik secara kualitatif
Kategori