3.3.3.3 Isolasi fragmen cDNA eglA
Fragmen cDNA eglA diisolasi dengan PCR menggunakan primer spesifik gen endoglukanase yang telah didesain. Komposisi PCR ialah 1 l cDNA total, 1x
bufer Taq, 0.25 unit Taq DNA polimerase, 2 mM MgCl
2
, 0.2 mM dNTPs, 20 pmol dari masing-masing primer forward dan reverse, DMSO 4 vv
konsentrasi final dan ddH
2
O dengan volume reaksi 20 l. PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR 95
o
C selama 5 menit diikuti dengan 30 siklus amplifikasi yang terdiri dari denaturasi 94
o
C selama 30 detik, annealing 57
o
C selama 30 detik, dan polimerisasi 72
o
C selama 2 menit dan pasca-PCR 72
o
C selama 5 menit dan pendinginan 15
o
C selama 5 menit.
3.3.3.4 Pengklonan fragmen cDNA eglA
Fragmen cDNA eglA yang telah diisolasi disisipkan ke dalam vektor pengklonan pGEM-T Easy Promega, Madison, WI, USA Lampiran 2 dan
diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α. Hasil PCR diligasikan dengan pGEM-T Easy mengikuti petunjuk produsen Promega yaitu dengan mencampur
7.5 ng hasil PCR, 10 ng pGEM-T Easy, 0.3 Weiss Unit T4 DNA ligase dan 1x bufer ligasi dengan volume reaksi 10 l, kemudian diinkubasi pada suhu 4
o
C selama semalam. Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α
menggunakan metode Suharsono 2002. Metode ini dilakukan dalam dua tahap, yaitu pembuatan sel kompeten dan transformasi bakteri. Sel kompeten dibuat
dengan membiakkan koloni tunggal E.coli DH5α dalam 2 ml media LB Luria- Bertani cair tripton 1 bv, ekstrak yeast 0.5 bv, NaCl 1 bv pada
suhu 37
o
C selama semalam dalam inkubator beragitasi 250 rpm. Sebanyak 100 l biakan E.coli DH5α kemudian dibiakkan kembali dalam 10 ml media LB cair
sampai mencapai OD
600
=O.5 densitas sel 4.10
7
– 7.10
7
selml. Sebanyak 1.5 ml biakan bakteri diendapkan dengan senrifugasi pada kecepatan 5000 rpm, suhu 4
o
C selama 10 menit. Endapan bakteri kemudian disuspensikan dalam 600 l bufer
transformasi TB 10 mM PIPES, 15 mM CaCl
2
.2H
2
O, 250 mM KCl, 55 mM MnCl
2
, pH 6,7 dan diinkubasikan dalam es selama 20 menit. Setelah disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4
o
C selama 10 menit, endapan bakteri diresuspensikan dengan 60 l TB, ditambah 4.2 l DMSO dan
diinkubasikan dalam es selama 20 menit. Transformasi dilakukan dengan mencampur sel bakteri kompeten yang dihasilkan dengan 10 l plasmid hasil
ligasi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Campuran kemudian diberikan kejutan panas dengan diinkubasi pada suhu 42
o
C selama 1 menit dan setelah itu diinkubasikan kembali dalam es selama 5 menit. Campuran kemudian ditambah
dengan 200 l media YT 16 gl tripton, 10 gl ekstrak yeast, 5 gl NaCl, pH 7,0 dan diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama 60 menit. Bakteri kemudian disebar dalam media agar LB yang mengandung 50 gml ampisilin, 10 l 100 mM
isopropiltio-β-galaktosida IPTG dan 50 l 2 bv X-gal 5-bromo-4-chloro-3- indolyl
-β-D-galactoside dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama semalam.
3.3.3.5 Seleksi transforman rekombinan
Kategori