congo red 1 bv selama 0.5-1 jam, diikuti destaining dengan larutan NaCl 1
M selama 15 menit. Adanya aktivitas enzim endoglukanase ditandai dengan terbentuknya zona bening. Untuk masing-masing isolat digunakan tiga ulangan.
Diameter koloni dan zona bening yang terbentuk diukur. Nisbah selulolitik dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
koloni diameter
koloni diameter
- zona
diameter R
selulotik Nisbah
=
3.3.2.2 Uji aktivitas enzim endoglukanase secara kuantitatif
Sebanyak 2 x 10
6
sporaml A. niger dan Trichoderma yang diproduksi pada media agar CMC diinokulasikan ke dalam 50 ml media CMC cair dalam erlenmeyer 250
ml Narashima et al. 2006. Untuk masing-masing isolat digunakan tiga ulangan. Kultur diinkubasi dalam inkubator beragitasi selama 7 hari pada kecepatan 150
rpm. Kultur di panen pada umur 7 hari setelah inokulasi. Pemisahan enzim kasar dari biomassa cendawan dilakukan dengan cara menyaring filtrat kasar cendawan
dengan kertas saring. Filtrat yang dihasilkan digunakan sebagai ekstrak kasar enzim. Aktivitas enzim endoglukanase diukur berdasarkan produk gula yang
dihasilkan dengan metode DNS asam dinitrosalisilat Ghose 1987. Sebanyak 0.5 ml filtrat ekstrak kasar enzim dicampur dengan 0.5 ml CMC 1 bv dalam
bufer sitrat 50 mM pH 4,8 dan diinkubasikan selama 30 menit pada suhu 50
o
C. Reagen DNS sebanyak 3 ml ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Setelah itu
tabung reaksi dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit, kemudian didinginkan pada suhu kamar dan dihitung nilai rapat optis O.D pada λ540 nm
terhadap blanko. Blanko dibuat dengan mengganti sampel dengan bufer sitrat 50 mM pH 4.8. Hasil pengukuran kemudian dimasukkan ke dalam persamaan kurva
standar glukosa yang telah dibuat untuk mengukur kadar glukosa Lampiran 1. Unit aktivitas enzim endoglukanase dihitung dengan rumus dibawah ini. Satu unit
aktivitas enzim endoglukanase didefinisikan sebagai kemampuan enzim dalam menghasilkan 1 mol glukosa per menit.
n pengencera
faktor x waktu
ml enzim
V x
glukosa BM
ppm glukosa
i konsentras
Unit x
=
Pengukuran kadar protein total dilakukan dengan metode Lowry Ghose, 1987. Sebanyak 0.5 ml ekstrak kasar enzim dimasukkan kedalam tabung reaksi
dan setelah itu ditambahkan 5 ml reagen C. Reagen C dibuat dengan mencampur 100 ml reagen A Na
2
CO
3
2 bv dalam NaOH 0.1N dan 2 ml reagen B CuSO
4
.5H
2
O 0.5 bv dalam K Tartarat 1 bv. Tabung kemudian divorteks dan didiamkan pada suhu kamar selama 10 menit. Setelah itu, ke dalam
tabung dimasukkan 0.5 ml Reagen D reagen folin Ciocalteau yang telah diencerkan dengan air sampai 1N. Tabung kemudian divorteks dan didiamkan
pada suhu kamar selama 30 menit. Nilai rapat optis O.D setiap isi tabung dibaca dengan menggunakan spektrofotometer pada λ750 nm terhadap blanko. Hasil
pengukuran kemudian dimasukkan ke dalam persamaan kurva standar bovine serum albumin
BSA yang telah dibuat untuk mengukur kadar protein Lampiran 1. Selanjutnya aktivitas spesifik enzim dapat ditentukan berdasarkan unitml
aktivitas enzim dan kadar protein yang didapat dengan rumus sebagai berikut.
mgml protein
kadar unitml
unit aktivitas
unitmg spesifik
aktivitas =
3.3.3 Isolasi gen penyandi endoglukanase A. niger IPB1 3.3.3.1 Isolasi RNA total
