disentrifugasi pada 5700 rpm Jouan BR4i selama 5 menit pada suhu 6
o
C. Endapan yang didapat dikeringkan dengan vakum selama 6 menit dan dilarutkan
dalam 20 l ddH
2
O yang mengandung diethylpyrocarbonate DEPC 0.1 vv. Kuantifikasi dilakukan dengan melarutkan 1 l suspensi RNA total dalam 700 l
air DEPC 0.1 vv, selanjutnya dibaca nilai rapat optisnya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm Sambrook et al. 1989.
Keutuhan RNA dianalisis secara kualitatif menggunakan elektroforesis, dengan memigrasikan RNA pada gel agarosa di dalam bufer morpholinopropanesulfonic
acid MOPS 1 vv 4,2 gl 3-morpholinopropanesulfonic acid C
7
H
15
NO
4
, 0.41 gl Na-Asetat, 0.37 gl Na
2
EDTA.H
2
O pada tegangan 100 volt selama 35 menit. Visualisasi RNA dilakukan di atas UV transiluminator GelDoc Labquip.
3.3.3.2 Sintesis cDNA total
Sintesis cDNA total dilakukan melalui proses transkripsi balik. Sebanyak 500 ng RNA total dicampur dengan 4 l 5x reverse transcriptase RT bufer, 1
unit Enzim reverse transcriptase Invitrogen, 10 pmol primer oligo dT, 2 l dithiothreitol
DTT 0.1 M, 2 l dNTPmix 2 mM dan ddH
2
O DEPC 0.1 steril konsentrasi final dalam volume 20 l. Reaksi transkripsi balik dilakukan pada
suhu 30
o
C selama 10 menit, diikuti oleh suhu 42
o
C selama 60 menit dan 95
o
C selama 5 menit.
Evaluasi terhadap keberhasilan sintesis cDNA total dilakukan dengan mengamplifikasi gen penyandi aktin dengan menggunakan primer spesifik gen
aktin dan cDNA total sebagai cetakannya. Komposisi reaksi PCR polymerase chain reaction
ialah 0.75 l cDNA total, 1x bufer Taq, 0.25 unit Taq DNA polimerase, 2 mM MgCl
2
, 0.2 mM dNTPs, 15 pmol dari masing-masing primer Act
F dan ActR2, dimethyl sulfoxide DMSO 4 vv konsentrasi final dan ddH
2
O dengan volume reaksi 15 l. Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi pra- PCR 95
o
C selama 5 menit diikuti dengan 30 siklus amplifikasi yang terdiri dari denaturasi 94
o
C selama 30 detik, annealing 57
o
C selama 30 detik, dan polimerisasi 72
o
C selama 2 menit dan pasca-PCR 72
o
C selama 5 menit dan pendinginan 15
o
C selama 5 menit
3.3.3.3 Isolasi fragmen cDNA eglA
Fragmen cDNA eglA diisolasi dengan PCR menggunakan primer spesifik gen endoglukanase yang telah didesain. Komposisi PCR ialah 1 l cDNA total, 1x
bufer Taq, 0.25 unit Taq DNA polimerase, 2 mM MgCl
2
, 0.2 mM dNTPs, 20 pmol dari masing-masing primer forward dan reverse, DMSO 4 vv
konsentrasi final dan ddH
2
O dengan volume reaksi 20 l. PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR 95
o
C selama 5 menit diikuti dengan 30 siklus amplifikasi yang terdiri dari denaturasi 94
o
C selama 30 detik, annealing 57
o
C selama 30 detik, dan polimerisasi 72
o
C selama 2 menit dan pasca-PCR 72
o
C selama 5 menit dan pendinginan 15
o
C selama 5 menit.
3.3.3.4 Pengklonan fragmen cDNA eglA
