L- Aspartate 232 mmolL
R2:
α-Ketoglutarate 51,3 mmolL
L-Aspartate 100 mmolL
2. Alat atau instrumen penelitian
a. Kandang
metabolic cage
b. Jarum untuk pemberian per-oral,
stopwatch,
timbangan elektrik c.
Alat untuk pembuatan serbuk kering daun sirsak antara lain :
oven
, blender, timbangan elektrik, ayakan no.40.
d. Alat-alat untuk penetapan kadar air antara lain : timbangan,
destilator
, gelas ukur,
stopwatch
, labu alas bulat,
Bekker glass
. e.
Alat-alat untuk pembuatan infusa daun sirsak antara lain :
Bekker glass
, panci lapis alumunium,
heater
elektrik
,
termometer, gelas ukur, gelas corong, s
topwatch
, timbangan elektrik, kain flanel. f.
Alat- alat untuk membedah tikus dan pengambilan serum darah antara lain : gunting,
scalpel
, pegangan
scalpel
,
petri disk
, pot untuk tempat organ, pipa kapiler, tabung
Effendorf
. g.
Alat untuk mengukur kadar SGOT ARCHITECT Ci 8200, Abbot
Laboratories
.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi daun sirsak
Determinasi dilakukan dengan cara mencocokkan ciri-ciri tanaman sirsak terutama terkait ciri-ciri daun sirsak dengan menggunakan buku acuan hingga ke
tingkat spesies. Determinasi diperiksa dan disahkan oleh Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan
Bahan uji yang digunakan adalah daun sirsak dalam kondisi baik berwarna hijau yang berada diantara ujung dan pangkal tangkai daun dan diperoleh dari
daerah Jalan Kaliurang Km.10, Sleman, Yogyakarta dan dipanen pada bulan Mei- Juni 2012 sebanyak tiga kali dan dilakukan pada pagi hari.
3. Pembuatan serbuk daun sirsak
Daun sirsak dicuci dengan air mengalir, lalu dikeringkan dengan cara dioven dengan suhu sekitar 50
o
C selama kurang lebih 3 hari. Daun sirsak yang telah kering kemudian diserbuk dengan blender dan dihaluskan menjadi serbuk
simplisia halus menggunakan ayakan serbuk no.40. Serbuk halus daun sirsak kemudian dihitung nilai rendemennya.
4. Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan menggunakan metode destilasi toluene. Cara kerja yang dilakukan mengacu pada buku acuan. Rangkaian alat
dipersiapkan dahulu, kemudian sebanyak 50 garam serbuk daun sirsak kering dimasukkan ke dalam labu ukur 500 ml, kemudian toluena dimasukkan sebanyak
200 ml ke dalam labu dan dihubungkan pada rangkaian alat. Labu dipanaskan selama 15 menit. Penyulingan dilakukan dengan kecepatan 2 tetes tiap detik
setelah toluene mulai mendidih hingga sebagian besar air tersuling, kemudian kecepatan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air tersuling, pada
bagian dalam tabung penerima dicuci menggunakan toluena. Penyulingan
dilanjutkan selama 5 menit dan tabung penerima dibiarkan dingin hingga suhu kamar. Volume air dibaca setelah air dan toluena memisah sempurna dan dihitung
kadar air dalam bentuk persen .
5. Penetapan dosis infusa daun sirsak
Penetapan peringkat dosis berdasarkan pada bobot tertinggi tikus, setengah volume maksimal pemberian sediaan dalam bentuk cairan secara peroral yaitu 2,5
ml, dan dosis lazim daun sirsak yang dikonsumsi oleh manusia dengan berat 70 kg sebanyak 2 gram serbuk. Penetapan dosis tertinggi daun sirsak dengan konsentrasi
maksimal yang dapat dibuat dalam bentuk infusa berdasarkan hasil orientasi pada penelitian ini sebesar 6 bv adalah sebagai berikut:
D x BB = C x V D x 300 g = 6 g 100 ml x 2,5 ml
D = 0,5 mgg BB = 500kg BB Dosis lazim daun sirsak sebagai dosis kedua, ditetapkan sebagai berikut :
Dosis manusia = 2 g70 kg BB = 2000 mg 70 kg BB Nilai konversi manusia 70 kg ke tikus 200 g = 0,018
Dosis II untuk 200 g tikus = 2 g x 0,018
= 0,036 g200 g BB = 0,18 mgg BB = 180 mgkg BB
Angka konversi ditentukan dengan cara sebagai berikut :
Penentuan peringkat dosis I dengan cara membagi dosis II dengan angka konversi dan diperoleh dosis I sebesar 108 mg kgBB, dosis III diperoleh dari
perkalian angka konversi dengan dosis II sehingaa diperoleh dosis 301mg kgBB, dan dosis IV diperoleh dari perkalian dosis III dengan angka konversi sehingga
diperoleh dosis sebesar 503 mgkgBB. Dosis untuk kontrol aquadest ditetapkan dengan cara sebagai berikut konsentrasi
air 1gml : D x BB = C x V
D x 300 g = 1 gml x 2,5 ml D = 8,333 mgg = 8333 mgkg
Dosis yang digunakan dalam penelitian ini secara berurutan adalah 108 ; 180 ; 301 ; dan 503 mgkgBB dan dosis kontrol aquadest sebesar 8333 mgkgBB.
6. Pembuatan infusa daun sirsak
Infusa daun sirsak dibuat dengan menimbang 6 gram serbuk daun sirsak dan dicampur dengan air sebanyak 100 ml
di dalam panci infusa, dipanaskan di atas tangas air selama 15 menit terhitung mulai suhu mencapai 90
C sambil sesekali diaduk.
7. Penyiapan hewan uji
Hewan uji yang digunakan berjumlah 50 ekor 25 ekor jantan dan 25 ekor betina yang diperoleh dari Laboratorium Imono Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
8. Pengelompokan hewan uji
Tikus berjumlah lima puluh ekor tikus, 25 ekor jantan dan 25 ekor betina, yang ditempatkan dalam
metabolic cage
, dikelompokkan secara
clustering random
, kemudian secara acak dikelompokkan menjadi 5 kelompok. Kelompok I- IV sebagai kelompok perlakuan yang diberi infusa daun sirsak dengan peringkat
dosis secara berturut-turut 108 ; 180 ; 301 ; dan 503 mgkg BB dan kelompok V sebagai kontrol aquadest dosis 8333 mgkg BB , dan diberikan secara peroral
dengan kekerapan satu kali sehari selama 30 hari.
9. Pengamatan
Sebelum perlakuan, darah semua tikus diambil untuk penentuan kadar aktivitas SGOT sebelum perlakuan. Selama 30 hari diberi infusa daun sirsak
dengan kekerapan satu kali sehari dan diberi pakan dan minum di dalam
metabolic cage
. Parameter yang diamati setiap hari adalah gejala klinis yang terlihat setelah pemejanan, berat badan tikus, dan konsumsi pakan dan minum
tikus. Pada hari ke 31 sebagian tikus dikorbankan dan dilakukan pengambilan darah untuk penentuan kadar aktivitas SGOT setelah perlakuan. Separuh dari total
tikus dikorbankan untuk dibuat preparat histologis jantung. Pada hari ke 31 sampai dengan hari ke 45 tikus diberi pakan dan minuman
tanpa perlakuan sediaan uji, lalu pada hari ke 46, tikus yang masil ada dikorbankan dan kemudian dibuat preparat histologi organ jantung sebagai uji
reversibilitas. Kriteria klinik pengamatan meliputi :
a. Pengamatan fisik terhadap gejala-gejala toksik.
b. Kematian hewan uji pada masing-masing kelompok.
c. Berat badan hewan uji yang ditimbang setiap hari.
d. Asupan pakan dan minum hewan uji.
10. Pengukuran kadar SGOT
a. Pengambilan serum darah
Cuplikan darah diambil melalui mata hewan uji. Darah yang ditampung dalam tabung efendorf yang sudah ditetesi dengan heparin. Darah kemudian
disentrifugasi untuk mendapatkan supernatan. Supernatan ini diambil dan digunakan untuk pemeriksaan kadar SGOT.
b. Pengukuran kadar darah SGOT dilakukan di Laboratorium Parahita
®
Diagnostic Center
Yogyakarta.
11. Pemeriksaan histologis
a. Pengambilan organ
Pengambilan organ dilakukan dengan mengorbankan hewan uji dengan cara dekapitulasi ditarik kepalanya hingga mati dan
euthanasia
dimasukkan ke dalam wadah yang sudah diberi eter kemudian dibedah pada bagian perut.
Selanjutnya organ jantung diambil kemudian dicuci dengan NaCl 0,9 dimasukkan kedalam wadah berisi formalin 10.
b. Pembuatan dan pemeriksaan preparat histopatologi
Jantung tikus dipotong-potong dengan mikrotom setebal 3mm-5mm, kemudian dimasukkan ke dalam formalin. Preparat histologi dibuat di
Laboratorium Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada
Yogyakarta. Hasil pemeriksaan dibuat fotomikroskopi dengan uraian secara deskriptif sebagai data kualitatif.
F. Tata Cara Analisis Hasil
