BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan adalah metode eksperimental. Tahap penelitian meliputi penyiapan bahan, perlakuan, pemberian obat kepada hewan
percobaan, pengambilan darah, darah yang didapat divorteks dan disentrifuge sehingga menjadi plasma. Selanjutnya menginjeksikan plasma pada alat
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT. Parameter yang dilihat adalah luas area dari plasma sehingga didapat besarnya kadar dari metoklopramida.
3.1 Waktu dan tempat penelitian.
Penelitian ini dilakuka n di Laboratorium Biofarmasi dan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatra Utara pada tanggal 20 Februari
2012 sampai tanggal 25 April 2012.
3.2 Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah timbangan hewan, beaker gelas oberol, neraca analitis, mat pipet oberol, pipet tetes, tabung
sentrifugasi, rak tabung, gelas ukur oberol, alat vortex, alat sentrifuga si, spuit 1 ml, spuit 3 ml, labu tentukur oberol, mikrotube, indikator universal, satu unit alat
KCKT Agilent 1120 Compact LC, kolom ODS C-18, wadah solven oberol, vial agilent, animal box, pompa vakum Gast DO, sonikator branson, kertas
membran filter cellulosa nitrate 0,45 μm whatman, kertas membran filter nylon
0,4 5 μm whatman, penyaring PTFE polytetraflouroethylen 0,2 μm whatman
dan alat lain yang dibutuhkan.
Universitas Sumatera Utara
3.3 Bahan
Bahan–bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu asam asetat glasial, asetonitril, metanol, aquabidestillata, metoklopramid HCl BP PT. Kairos
Tritunggal, trikloroasetat TCA 20 dan heparin.
3.4 Pembuatan Larutan Baku 3.4.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Metoklopramid
Ditimbang seksama 10,0 mg metoklopramid BP, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, ditambahkan aquabides hingga larut dan dicukupkan sampai
10 ml. Maka didapat larutan dengan konsentrasi 1000 mcgml.
3.4.2 Pembuatan Larutan Induk Baku II Metoklopramid
Dari larutan induk baku I, dipipet 1 ml, lalu dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan aquabides hingga 10 ml. Maka didapat larutan
dengan konsentrasi 100 mcgml.
3.4.3 Pembuatan Larutan Induk Baku III Metoklopramid
Dari larutan induk baku II, dipipet 1 ml , lalu dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan aquabides hingga 10 ml. Maka didapat larutan
dengan konsentrasi 10 mcgml.
3.5 Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan terdiri dari larutan asam asetat glacial 1 dalam aquabidest dan larutan metanol-asetonitril 1 : 3,7, di mana larutan asam
asetat glasial dan campuran metanol-asetonitril berbanding 60 : 40. Munson, 1991.
Universitas Sumatera Utara
3.6 Pencampuran Fase Gerak
Dipipet asam asetat glasial 5 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur dan dicukupkan dengan aquadest hingga 500 ml, dicek pH pH = 4, lalu disaring
dengan menggunakan membrane filter cellulose nitrat 0,45 µm. Kemudian sebanyak 185 ml asetonitril dan 50 ml metanol atau dengan perbandingan 3,7 : 1
dicampur, lalu disaring dengan menggunakan membrane filter nylon 0,45 µ m. Masing-masing fase gerak disonikasi selama 30 menit.
3.7 Penyiapan Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.
Alat kromatografi yang telah dirangkai sedemikian rupa dihidupkan. Dimana pengukuran dilakukan dengan menggunakan kolom Agilent XDB-C18,
laju alir 1 mlmenit, detector PDA pada panjang gelombang 273 nm. Pompa yang digunakan mode perbandingan berubah-ubah dalam waktu tertentu dengan sistem
elusi gradien. Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak
dibiarkan mengalir selama lebih kurang 30 menit sampai diperoleh garis tanda yang datar sehingga menandakan sistem tersebut telah stabil. Sehingga KCKT
siap untuk digunakan.
3.8 Penentuan Perbandingan Fase Gerak dan Laju Alir sistem KCKT
Kategori