3.6 Pencampuran Fase Gerak
Dipipet asam asetat glasial 5 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur dan dicukupkan dengan aquadest hingga 500 ml, dicek pH pH = 4, lalu disaring
dengan menggunakan membrane filter cellulose nitrat 0,45 µm. Kemudian sebanyak 185 ml asetonitril dan 50 ml metanol atau dengan perbandingan 3,7 : 1
dicampur, lalu disaring dengan menggunakan membrane filter nylon 0,45 µ m. Masing-masing fase gerak disonikasi selama 30 menit.
3.7 Penyiapan Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.
Alat kromatografi yang telah dirangkai sedemikian rupa dihidupkan. Dimana pengukuran dilakukan dengan menggunakan kolom Agilent XDB-C18,
laju alir 1 mlmenit, detector PDA pada panjang gelombang 273 nm. Pompa yang digunakan mode perbandingan berubah-ubah dalam waktu tertentu dengan sistem
elusi gradien. Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak
dibiarkan mengalir selama lebih kurang 30 menit sampai diperoleh garis tanda yang datar sehingga menandakan sistem tersebut telah stabil. Sehingga KCKT
siap untuk digunakan.
3.8 Penentuan Perbandingan Fase Gerak dan Laju Alir sistem KCKT
Larutan metoklopramid baku dengan konsentrasi 10 mcgml diinjeksikan sebanyak 10 ul kedalam sistem KCKT menggunakan campuran fase gerak Asam
asetat glasial 1 dalam air dan campuran metanolasetonitril 1:3,7 , di mana
Universitas Sumatera Utara
perbandingan campuran asam asetat glasial dalam air dan campuran metanolasetonitril adalah 60 : 40, dengan laju alir yang tetap 1 ml per menit.
3.9 Bahan-bahan yang digunakan pada formulasi tablet Metoklopramid Bahan Tambahan Sari Tape.
Metoklopramid HCl Baku Pabrik PT. Kairos Tritunggal, Sari tape padat Brem, corn starch, avicel, LH-11, aspartam, Mg. stearat, dan talkum. Tablet
metoklopramid bahan tambahan sari tape diperoleh dari Penelitian Disertasi Drs. Samran, M.Si., Apt.
3.10 Perlakuan Terhadap Hewan Percobaan 3.10.1 Hewan Percobaan
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah kelinci jantan dengan berat 1,5-2 kg, yang telah dikondisikan terhadap lingkungan dan
makanannya selama 1 minggu dan diberi makanan kangkung dan wartel selama penelitian berlangsung. Kelinci yang diambil darahnya adalah kelinci yang telah
diberi tablet metoklopramid bahan tambahan sari tape dan tablet metoklopramid merek dagang Primperan
secara peroral. Waktu pengambilan darah adalah 10 menit setelah pemberian obat.
3.10.2 Penyiapan Plasma
Kelinci dipuasakan minimal 8 jam sebelum percobaan. Ditimbang dan dibersihkan bulu telinganya hingga bersih. Ambil darah 2 ekor kelinci jantan
masing-masing lebih kurang 5 ml, dibagi dalam 4 tabung yang telah berisi 2 tetes heparin, masing-masing ditambahkan 2 ml TCA 20, kemudian disentrifuge
Universitas Sumatera Utara
3000 rpm selama 10 menit. Diambil masing-masing supernatan dan digunakan sebagai blanko dan kurva kalibrasi.
3.10.3 Penentuan Kurva Kalibrasi
Larutan induk baku III dengan konsentrasi 10 mcgml, dipipet sebanyak 0,05 ml, 0,1 ml, 0,15 ml, 0,2 ml dan 0,25 ml setara dengan konsentrasi 0,5; 1; 1,5;
2; dan 2,5 mcgml. Masing–masing dimasukkan ke dalam vial dan dicukupkan dengan plasma 1 ml. Diukur kadarnya dengan menggunakan alat KCKT dengan
menyuntikkan supernatan sebanyak 10 µl.
3.10.4 Penetapan Kadar Metoklopramid Bahan Tambahan Sari Tape dan Metoklopramid merek dagang dalam Plasma Darah Kelinci
Pengujian dilakukan dengan metode Cross Over Design menggunakan 6
kelinci. Pemberian metoklopramid pada hewan kelinci dengan metode ini dapat dilihat pada Tabel 1.
Table 1. Pemberian Metoklopramid pada kelinci dengan metode Cross Over
Design.
PERLAKUAN I
Istirahat Selama
1 minggu
PERLAKUAN II KELINCI
SEDIAAN KELINCI
SEDIAAN
1 A
1 B
2 A
2 B
3 A
3 B
4 B
4 A
5 B
5 A
6 B
6 A
Keterangan: A = Tablet Metoklopramid 10 mg dengan Bahan Tambahan Sari Tape
B = Tablet Primperan® 10 mg
Universitas Sumatera Utara
Prosedur penentuan konsentrasi metoklopramid dalam plasma : 1. Kelinci dipuasakan selama lebih kurang 8 jam.
2. Diambil 1 ml darah kelinci dan digunakan sebagai blanko 3. Diberikan sediaan tablet metoklopramid secara per oral.
4. Dibilas spuit dengan heparin dan diambil 1 ml darah kelinci melalui vena marginal setelah 10 menit pemberian obat, kemudian 20, 30, 45, 60, 90,
120, 180, 300, dan 420 menit. 5. Dimasukkan kedalam tabung sentrifuge yang telah berisi 2 tetes heparin.
6. Ditambahkan TCA 20 sebanyak 1 ml lalu divorteks hingga homogen 7. Disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit untuk diambil
supernatannya, dan masing-masing disaring dengan menggunakan membrane filter PTFE 0,2 um.
8. Diukur kadarnya menggunakan alat KCKT dengan menyuntikkan supernatan sebanyak 10 ul.
3.11 Analisis Data
Data hasil penelitian yang diperoleh, kemudian ditentukan parameter bioavailabilitanya, yaitu
, , dan AUC. Untuk mengetahui apakah harga
variansinya sama besarnya atau tidak, maka dilakukan uji pendahuluan untuk hipotesis Jones, 2002.
H : σ
1 2
= σ
2 2
H
1
: σ
1 2
≠ σ
2 2
Pengujian Hipotesi f = S
1 2
S
2 2
Universitas Sumatera Utara
dibandingkan dengan nilai kritis: f
α2 , v1, v2
Bila f hitung f kritis diterima, maka harga kedua variansi tersebut adalah sama, maka uji selanjutnya dalam membedakan dua rata-rata
menggunakan uji t. H : µ
1
= µ
2
H
1
: µ
1
≠ µ
2
Pengujian hipotesis t =
2 1
2 1
1 1
r r
s y
y +
−
s =
2 1
2 1
2 2
1 2
2 1
2 2
1 1
1 2
1
2 2
\ 1
1
− +
− +
−
∑ ∑
∑ ∑
= −
− =
r r
r y
y r
y y
r i
i r
i i
r i
r i
i i
atau:
s =
nilai t hasil pengujian statistik ini kemudian dibandingkan dengan nilai kritis t
tabel
, yaitu ±t
α2 , v1, v2
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Penentuan perbandingan fase gerak 1 asam asetat glasial dalam air dan campuran asetonitril-MeOH metanol 3,7 : 1 dilakukan terlebih dahulu sebelum
dilakukan penetapan kadar metoklopramid dalam plasma pada panjang gelombang 273 nm. Setelah fase gerak diperoleh kemudian ditentukan laju alir,
waktu tambat dan tekanan kolom yang optimal. Hasil orientasi menentukan perbandingan fase gerak terlampir pada Lampiran 2, halaman 41. Kemudian
dilakukan penyuntikan larutan plasma yang ditambah dengan larutan metoklopramid BP dengan konsentrasi 100 mcgml sebanyak 10 µ l ke dalam
sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT dengan perbandingan fase gerak yang terdiri dari: a Campuran 1 asam asetat glasial dalam air dan, b
campuran asetonitril-metanol 3,7 : 1, di mana a : b = 60:40 dan laju alir 1 mlmenit diperoleh waktu tambat 1,7 seperti yang tertera pada Gambar 4.
Gambar 4. Kromatogram hasil penyuntikan larutan Metoklopramid BP dengan
konsentrasi 100 mcgml dalam plasma, dengan fase gerak a Campuran 1 Asam asetat glasial dalam Air dan, b Campuran
Asetonitril-methanol 3,7 : 1, dimana a : b = 60:40.
Universitas Sumatera Utara
Kategori