20
d. Tahapan asilasi dengan larutan benzoil klorida
Dua mL benzoil klorida dilarutkan dalam 100 mL asetonitril benzoil klorida 2. Derivatisasi dilakukan dengan menambahkan larutan baku kerja dan sampel
dengan 1 mL benzoil klorida 2 dan 2 mL NaOH 2 M, vortex selama 1 menit. Diamkan dalam temperatur ruang selama 5 menit dan di sentrifugasi selama 10
menit 25000 rpm. Reaksi asilasi dihentikan dengan penambahan 2 mL NaCl jenuh. Hasil derivatisasi diekstraksi tiga kali dengan 3 mL dietil eter. Lapisan
organik dievaporasi, residu yang diperoleh dilarutkan dengan 2 mL asetonitril.
Alikuot 20 uL diinjeksikan ke sistem KCKT.
e. Penyiapan Fase gerak
0,7708 gram ammonium asetat ditimbang dan dilarutkan dalam air pro KCKT sampai 1000 mL sehingga diperoleh ammonium asetat 0,01 M. Fase gerak
merupakan campuran ammonium asetat 0,01 M:asetonitril dengan perbandingan 40:60.
f. Pembuatan Kurva kalibrasi
Kurva kalibrasi dibuat dengan menghubungkan antara konsentrasi dengan luas puncak larutan derivat histamin. Konsentrasi derivat histamin yang digunakan
antara 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, dan 28 µg mL. Dari hubungan konsentrasi larutan derivat histamin terhadap luas kromatogram yang terukur diperoleh persamaan
regresi linier.
g. Sistem KCKT
Fase gerak sistem gradien campuran ammonium asetat 0,01 M: asetonitril dengan perbandingan 40:60. Disaring dengan penyaring membran 0,45 µm dan
diawaudarakan. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 254 nm. Uji kesesuaian sistem dilakukan terhadap salah satu
konsentrasi larutan derivat histamin Nilai simpangan baku relatif dari luas area dan waktu retensi 2,0 . Kondisi optimum untuk pengukuran dicari dengan
mengubah parameter perbandingan fase gerak dan laju alir.
21
h. Penetapan kadar histamin dalam sampel ikan kalengan
Sejumlah lebih kurang 5 gram sampel ikan ditimbang seksama kemudian ditambahkan 20 mL asam trikloroasetat dan dikocok selama 3 menit kemudian
disentrifugasi 2500 rpm selama 10 menit dan disaring dengan kertas Whatman No.1. Alikuot dilarutkan dengan 50 mL asam trikloroasetat kemudian disimpan di
refrigerator sebelum dianalisis. Tahapan asilasi dilakukan seperti larutan baku dan disaring dengan penyaring membran 0,45 µm dan diawaudarakan, kemudian
dianalisis dengan KCKT detektor UV pada panjang gelombang 254 nm.
IV.3.2. Penetapan dengan metode ELISA a. Persiapan
Semua reagen didiamkan kurang lebih 1 jam termasuk reagen asilasi pada suhu kamar 20-25 °C sebelum digunakan, kemudian dilarutkan 1 bagian washing
buffer ke dalam 24 bagian aquadest.
b. Tahapan Asilasi
Setiap larutan standar dan sampel dip ipet 100 μl ke dalam masing-masing tabung
asilasi. Kemudian dit ambahkan 25 μl reagen asilasi ke dalam masing-masing
tabung dan 200 μl buffer asilasi ke dalam masing-masing tabung. Campuran
dalam plate mikrowell digoyangkan dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar 20-25 °C kemudian a
likuot 25 μl larutan digunakan untuk tahap ELISA.
c. Penetapan kadar histamin dalam sampel ikan kalengan
Sejumlah lebih kurang 1 gram sampel ikan ditimbang seksama, kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifus dan ditambahkan 9 ml aquadest. Divortex
selama 3 menit dan disentrifus selama 5 menit pada 2500 g pada suhu kamar 20- 25 °C. Cairan supernatan dipipet langsung sebanyak 1 ml dan dipindahkan ke
dalam vialtabung bertutup ukuran 10 ml. Kemudian ditambahkan 9 ml aquadest divortex selama 30 detik. Larutan tersebut dip
ipet 200 μl ke dalam vialtabung baru dan ditambahkan 9.8 ml aquadest, kemudian divortex kembali selama 30
detik dan 100 μl larutan digunakan untuk tahap asilasi.
22
d. Tahapan ELISA
Kategori