Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT

12

II.5 Metode Analisis Histamin

Berbagai metode pengujian yang ada untuk penentuan kadar histamin pada ikan, termasuk Association of Analytical Communities AOAC metode fluorometri AOAC 977,13, metode spektrofluorometri, metode enzyme-linked immunosorbent assay ELISA, tes kolorimetri enzim dan metode kromatografi cair kinerja tinggi KCKT yang dapat mengukur beberapa amina biogenik Etienne, dkk., 2006. Sementara masing-masing metode memiliki kelebihan dan keterbatasan dari segi biaya, keahlian operator, waktu untuk memperoleh hasil, dan lain-lain. Metode yang paling baik dan handal dalam mengukur histamin dalam makanan laut menurut Standar Codex adalah metode fluorometri AOAC 977,13 atau metode ilmiah lainnya yang setara dan divalidasi.

II.5.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT

Kromatografi merupakan teknik pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu sampel yang dibawa fase gerak melewati fase diam dapat berbentuk padat atau cairan. Kromatografi cair kinerja tinggi KCKT adalah kromatografi cair kolom modern, dimana teori dasarnya bukan baru tapi hasil pengembangan dari kromatografi cair kolom klasik. Kemajuan dalam teknologi kolom, pompa tekanan tinggi dan detektor yang peka telah menyebabkan perubahan kromatografi cair kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien. Pada KCKT diperkenalkan penggunaan fase diam yang berdiameter kecil dalam kolom yang efisien. Teknologi kolom partikel kecil 3-5 µm ini memerlukan sistem pompa bertekanan tinggi yang mampu mengalirkan fase gerak dengan tekanan tinggi agar tercapai laju aliran 1-2 mlmenit. Oleh karena sampel yang digunakan sangat kecil 20µg maka diperlukan detektor yang sangat. Dengan teknologi ini, pemisahan berlangsung sangat cepat dengan daya pisah sangat tinggi. Selama bertahun-tahun sejumlah metode KCKT yang berbeda telah diusulkan. Setelah ekstraksi amina langkah derivatisasi diperlukan, dapat dilakukan sebelum atau sesudah pemisahan kolom, derivatif utama yang digunakan adalah o- phthaldialdehyde OPA, dansil klorida dan benzoil klorida. Metode derivatisasi 13 dengan agen fluorogenik memiliki beberapa keterbatasan, yaitu memerlukan pemisahan amina sebelum derivatisasi karena derivatif fluorogenik menghasilkan resolusi yang kurang bagus. Oleh karena itu, reagen asil klorida, seperti tosyl- dansil, atau benzoil klorida, lebih disukai untuk derivatisasi amina biogenik Etienne, dkk., 2006. Di antara reagen ini, benzoil klorida memiliki keuntungan, karena derivatisasi dan waktu elusi yang pendek, struktur kimia yang sederhana, dan relatif murah Zogul, dkk., 2002, Ozdestan, dkk., 2009. Beberapa prosedur menggunakan dansil klorida untuk derivatisasi telah diterbitkan Widjaya, dkk., 2001, Lubis, dkk., 2008. Metode dengan pra atau pasca kolom derivatisasi dengan orthophthalaldehyde digambarkan Solano, dkk., 2012, Muscarella, dkk., 2013. Beberapa prosedur menggunakan benzoil klorida untuk derivatisasi juga telah diterbitkan antara lain oleh Hwang, dkk., 1997, Zogul, dkk., 2002, 2004, Tsai, dkk., 2005, Yegin, dkk., 2008, Anderson, 2008, Chang, dkk., 2008, Ozdestan, dkk., 2009, Tahmouzi, dkk., 2011, Naila, dkk., 2011, Chong, dkk.,2012, Zare, dkk., 2013 dan Gezginc, dkk., 2013. Metode KCKT lain tidak melibatkan derivatisasi, tetapi menggunakan kromatografi ion diikuti oleh deteksi elektrokimia atau detektor diode array.

II.5.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA