METODE PENELITIAN

BAB IV METODE PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian

Eksperimental

4.2 Lokasi Penelitian

a. Pengambilan urin dilakukan di Laboratorium Dasar Bersama Kampus B Universitas Airlangga Surabaya di bawah pengawasan

Dokter yang bersangkutan.

b. Optimasi serta identifikasi flavonoid dan metabolitnya dalam urin dilakukan di Laboratorium Analisis Farmasi Universitas Airlangga

dan Laboratorium PT Angler BioChemLab Surabaya.

4.3 Bahan Penelitian

4.3.1 Bahan Obat

Kapsul ekstrak gandarussa (sediaan ekstrak etanol daun Justicia gendarussa Burm. f. ) dibuat oleh PT. Sido Jodo. Merupakan sediaan kapsul gandarusa yang mengandung 450,0 mg ekstrak.

4.3.2 Bahan Kimia

Bahan kimia yang dipakai dalam proses analisis adalah: -

Metanol untuk HPLC -

Standar apigenin (Merck SIGMA-ALDRICH Co) -

Senyawa marker gendarusin A Departemen Farmakognosi dan Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.

- Asetonitril -

Aqua for irrigation -

Gas nitrogen

4.4 Alat – alat

4.4.1 Treatmen dan Preparasi

- Beaker glass - Venoject - Tabung reaksi

- Apendorf - Vorteks mixer

- Microsyringe - Sentrifuge

-Vial

- Spuit injeksi -Filter holder - Corong pisah

-Ultrasonik -Neraca analitik

- Membran filter nylon 0,2 µm -Gelas ukur

4.4.2 Instrumen Analisis

Instrumen yang digunakan dalam penelitian ini adalah LC- MS/MS QTRAP 4000 series agilent Triple Quadrupole dan HPLC Agilent 10 dengan spesifikasi: HPLC Agilent 1100: - Agilent 10 Series Diode Array Detektor G1315A - HPLC Column Novapak Waters C18 3,9 X 150 MM 60 Å, 4 µm - Guard Column LC-MS/MS: - Kolom eclipse plus C-18 4,6 x 50 mm 3,5 um - Agilent QTRAP 4000 series MS Detector

4.5 Subyek Penelitian

Diperlukan 4 volunteer pria sehat. Jumlah tersebut berdasarkan penelitian dari Courts dan Williamson tahun 2009 tentang identifikasi metabolit aspalathin (C-glycosyl flavonoid) yang menggunakan 2 subyek Diperlukan 4 volunteer pria sehat. Jumlah tersebut berdasarkan penelitian dari Courts dan Williamson tahun 2009 tentang identifikasi metabolit aspalathin (C-glycosyl flavonoid) yang menggunakan 2 subyek

A. Populasi

4 volunteer pria sehat pria sehat, usia 20 – 40 tahun.

B. Kriteria Inklusi

1. Telah melakukan pemeriksaan laboratorium dan dinyatakan sehat. Pemeriksaan laboratorium yaitu glukosa darah puasa dan

2 jam setelah makan, fungsi ginjal (kreatinin dan ureum), fungsi hati (SGOT, SGPT) bagi subyek yang tidak memiliki data laboratorium tersebut selama 3 (tiga) bulan terakhir

kholesterol total, koleserol-LDL, trigliserida, kolesterol-HDL, viskositas darah dan agregasi trombosit

serta

2. Telah bersedia menandatangani informed consent sebelum proses penyaringan.

4.6 Prosedur Penelitian

Tahap-tahap perlakuan terhadap subyek adalah sebagai berikut:

1. Subyek berjumlah 4 orang, masing-masing diberi sediaan kapsul gandarusa dengan dosis 900 mg ekstrak (setara dengan 3,78 mg

gendarusin A) daun Justicia gendarussa Burm F (2 kapsul), sekali per oral setengah jam sesudah makan pagi.

2. Subyek diharuskan puasa selama 8 jam sebelum diberikan kapsul ekstrak etanol daun Justicia gendarussa Burm. f dan dilakukan

pengambilan urin blanko dari masing masing subyek sebelumnya.

3. Dilakukan karantina terhadap seluruh subyek penelitian selama 24 jam.

4. Setelah pemberian obat, sampel urin dari masing-masing subyek penelitian diambil pada interval 0-24 jam, dicatat waktu serta volume

urin yang tertampung (Mullen et al, 2008)

5. Subyek disarankan untuk minum air putih sebanyak 250 ml setiap 30 menit setelah minum obat selama 2 jam.

6. Sampel urin dikumpulkan menjadi satu dan terpisahkan masing-masing subyek serta dicatat waktu dan volume dari masing-masing poin

pengambilan urin.

7. Masing-masing sampel urin diambil menggunakan beaker besar dan diukur volumenya dengan gelas ukur. Selanjutnya seluruh sampel urin disimpan dalam lemari es suhu -20 o

C sebelum dilakukan analisis.

4.7 Penentuan Kondisi HPLC untuk Pendahuluan (preliminary).

Sebelum dilakukan analisis dengan menggunakan LC-MS/MS terlebih dahulu digunakan metode HPLC. Sebelumnya telah dilakukan penelusuran pustaka untuk menentukan kondisi HPLC yang sesuai untuk menganalisis gendarusin A dan bentuk aglikonnya yaitu apigenin, sebelum dilakukan analisis lebih lanjut menggunakan LC-MS/MS.

4.7.1 Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum

Instrument yang digunakan dalam analisis gendarusin A dilengkapi dengan UV-VIS Detektor. Untuk mendapatkan tanggap detektor yang optimum, analisis dilakukan pada panjang g elombang maksimum ( maks ). Pemilihan maksimum dilakukan dengan cara menginjekkan larutan baku gendarusin A dalam metanol ke dalam kolom HPLC dan dianalis a pada yang berbeda yaitu pada 270, 254, dan 340 nm.

4.7.2 Optimasi Fase Gerak

Dilakukan pemilihan dan pengaturan perbandingan fase gerak dengan berbagai komposisi yang memberikan hasil pemisahan terbaik. Fase gerak yang pernah digunakan untuk analisis gendarusin A adalah fase gerak metanol dan asam fosfat 0,2% dengan sistem gradien yang memberikan waktu retensi gendarusin A yang tidak terlalu lama dan menghasilkan peak gendarusin A yang tidak bertumpukan dengan peak komponen endogen urin (Sihabuddin, 2009). Untuk optimasi selanjutnya dilakukan pemilihan fase gerak lagi karena untuk mengindari buffer seperti asam fosfat pada pemakaian LC-MS/MS. Optimasi fase gerak yang dilakukan dengan sistem gradien berdasarkan literatur:

Tabel 4.1 Fase gerak yang digunakan. Fase gerak

Komposisi fase gerak (% v/v)

II Waktu (Sihabuddin, 2009) (menit ke-)

Metanol

0,2 % asam fosfat

Aquadest for HPLC

4.8 Optimasi Metode Pendahuluan (preliminary)

Optimasi preliminary dilakukan dengan menggunakan HPLC untuk mengetahui pemisahan dan recovery dalam urin dari senyawa gendarusin A. Hasil optimasi tersebut digunakan sebagai dasar analisis dengan menggunakan metode LC-MS/MS. Optimasi tersebut dipergunakan untuk melihat komponen matriks yang mempunyai pengaruh di analisis, mengoptimasi cara ekstraksi, mengoptimasi fase gerak, dan melihat bila ada interaksi yang terjadi dalam urin.

4.8.1 Optimasi Standar Gendarusin A dan Apigenin.

Membuat larutan baku induk dari standar gendarusin A 64 ppm dalam 10 ml pelarut methanol dan apigenin 100 ppm 5 ml dalam pelarut asetonitril dan aquadest. Selanjutnya dilakukan pengenceran dari kadar tersebut menjadi kadar yang lebih kecil untuk diinjekkan ke dalam kolom HPLC sebanyak 20 µl. Optimasi standar ini dilakukan untuk melihat waktu retensi yang optimal untuk standar berdasarkan panjang gelombang dan fase gerak terpilih baik untuk gendarusin A dan apigenin. Karena kedua senyawa Membuat larutan baku induk dari standar gendarusin A 64 ppm dalam 10 ml pelarut methanol dan apigenin 100 ppm 5 ml dalam pelarut asetonitril dan aquadest. Selanjutnya dilakukan pengenceran dari kadar tersebut menjadi kadar yang lebih kecil untuk diinjekkan ke dalam kolom HPLC sebanyak 20 µl. Optimasi standar ini dilakukan untuk melihat waktu retensi yang optimal untuk standar berdasarkan panjang gelombang dan fase gerak terpilih baik untuk gendarusin A dan apigenin. Karena kedua senyawa

4.8.2 Optimasi Serapan Standar dan Blanko Urin

Optimasi serapan blanko urin ini dipergunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya peak yang muncul dari blanko urin yang mengganggu analit. Blanko urin dipreparasi dengan cara ekstraksi terpilih. Hasil ekstraksi kemudian diinjekkan ke dalam kolom HPLC. Diamati kromatogram yang terjadi. Urin blanko ditambahkan larutan standar gendarusin A dengan konsentrasi tertentu kemudian dipreparasi untuk selanjutnya diinjeksikan ke dalam kolom HPLC. Diamati kromatogram yang terjadi sehingga diperoleh prosen rekoveri dan selektivitasnya.

4.8.3 Uji Selektivitas

Uji selektivitas bertujuan untuk mengetahui pemisahan gendarusin

A dengan komponen-komponen lain yang terkandung dalam urin. Dapat diketahui dengan menentukan resolusi (Rs), yaitu parameter yang menggambarkan pemisahan kromatogram campuran dua analit yang mempunyai waktu retensi berbeda. Resolusi ini ditentukan dengan menginjekkan blanko urin dan larutan gendarusin A yang ditambahkan dengan konsentrasi tertentu ke dalam kolom HPLC. Resolusi mengukur perbedaan waktu retensi dari dua macam analit yang dibagi dengan lebar dasar puncaknya (W). Resolusi dapat dihitung menggunakan rumus :

Rs = 2 ( tRB- tRA)

(WA+WB) (WA+WB)

kedua sisi puncak dengan poros horizontal. Untuk mendapatkan pemisahan yang baik, harga resolusi > 1,5. Apabila dua puncak menghasilkan harga resolusi yang kecil atau bahkan <

1, maka dua puncak tersebut saling berhimpitan (over lapping) (Mulja dan suharman, 1995).

4.8.4 Penentuan Perolehan Kembali (recovery)

Menentukan kembali konsentrasi gendarusin A dalam urin (rekoveri) dibuat larutan gendarusin A dalam urin, yaitu urin blanko dan larutan baku gendarusin A dengan konsentrasi 6,4 dan 25.6 ppm masing- masing direplikasi sebanyak tiga kali lalu diinjekkan ke dalam kolom HPLC sebanyak 20 µl. Rekoveri dihitung menggunakan dengan rumus berikut:

% rekoveri = kadar yang diperoleh x 100%

kadar sebenarnya

Prosen rekoveri yang diperoleh kemudian di rata-rata. Nilai prosen rekoveri yang memenuhi syarat adalah 80-110 % (Huber, 2004)

4.9 Penentuan Kondisi LC-MS/MS.

4.9.1 Optimasi Kondisi Kromatografi.

Optimasi kondisi kromatografi dilakukan untuk mendapatkan pemisahan analit yang baik, den gan parameter α dan Rs. Optimasi dilakukan dengan menggunakan sistem elusi yang terbaik, laju alir dan temperatur kolom yang menghasilkan pemisahan metabolit dalam urin optimal.

4.9.2 Optimasi Fase Gerak

Fase gerak untuk LC-MS/MS dioptimasi dengan menggunakan HPLC dan digunakan fase gerak yang sama dengan hasil optimasi tersebut.

4.9.3 Optimasi Kondisi MS

Electrospray Ionization (ESI) LC-MS/MS dioptimasi dengan kondisi tertentu. Dilakukan tuning dengan infusi standar gendarusin A dan apigenin ke dalam vakum ionisasi untuk memperoleh spektrum masa dan kondisi MRM yang optimal. Kriteria identifikasi: analisis dengan menggunakan MRM (Multiple reaction monitoring) menghasilkan rasio ion dengan penyimpangan maksimum 20 %.

Optimasi kondisi MS ini dapat memberikan respon yang optimal dalam analisis metabolit dalam urin. Berupa optimasi drying gas flow, drying gas temperature, nebulizer gas, Vcap, fragmentor. Analisis metabolit ekstrak gendarusa menggunakan ion spesifik yang merupakan hasil fragmentasi MS/MS. Untuk memperoleh ion spesifik dalam analisis LC- MS/MS dilakukan dengan mode scan tipe: MS2 produk ion. Selanjutnya dilakukan optimasi collision energy untuk melihat energi yang diperlakukan untuk menghasilkan product ion dengan jumlah maksimal (Yuwono, 2009).

4.9.3 Penentuan LOD dan LOQ

Penentuan batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ) bertujuan untuk mengetahui konsentrasi analit terendah yang dapat dideteksi, sedangkan penentuan batas kuantifikasi bertujuan untuk mengetahui konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi eksperimen yang ditentukan. Berdasarkan ISO 11843 untuk menghitung batas deteksi

(CC α) adalah dengan memplot sinyal dengan konsentrasi lalu menghubungkan konsentrasi pada y-intersep ditambah 2,33 dikalikan standar deviasi dari analisis dalam laboratorium. Sedangkan batas kuantifikasi (CCβ) dihitung dengan menambah konsentrasi pada batas deteksi ditambah 1,64 kali standar deviasi dari analisis dalam laboratorium (Council Directive 96/23/EC Europen Community).

4.10 Preparasi Sampel

1. 2-5 ml urin (pada masing-masing interval dikumpulkan) ditambah metanol (1:1, v/v), diultrasonikasi selama 15 menit dalam tabung.

2. Sampel kemudian divortex selama 5 menit lalu disentrifuse dengan kecepatan 4.000 rpm selama 10 menit.

3. Supernatan yang diperoleh dikumpulkan pada tabung yang berbeda, proses tersebut (tahap 1-2) diulang dua kali.

4. Supenatan tersebut dipekatkan menggunakan gas nitrogen lalu direkonstitusi kembali dengan metanol 500 ul dan diultrasonikasi

selama 10 menit.

5. Sampel kemudian disentrifuse dengan kecepatan 6.000 rpm selama 10 menit, supernatan disaring menggunakan membran filter nylon 0,2 m kemudian 20 l supernatant diinjeksikan ke dalam HPLC. (Sihabuddin, 2009)

4.11 Pengolahan Data

Standar gendarusin A dan apigenin dilakukan infusi ke dalam MS untuk menentukan MRM pada kondisi tuning optimal. Dipilih kelimpahan ion yang cukup dari hasil fragmentasi pada standar pada kondisi tuning Standar gendarusin A dan apigenin dilakukan infusi ke dalam MS untuk menentukan MRM pada kondisi tuning optimal. Dipilih kelimpahan ion yang cukup dari hasil fragmentasi pada standar pada kondisi tuning